【背景】颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)是人体比较重要且复杂的关节,下颌髁突软骨常常因外伤、炎症、骨关节病等引起损伤。由于关节软骨没有血管组织,所以自身对于缺损的修复能力较弱,常无法自行修复并导致进一步破坏。严重者造成关节功能丧失,对病人的生活造成极大障碍。目前,虽有多种方法用于修复软骨缺损,但这些修复的方法都存在很多的局限性。探索一种有效的软骨修复方法就成为了一种迫切的需求。组织工程技术的出现,使越来越多的人通过组织工程的方法来修复软骨缺损。前期课题组通过未分化的脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)修复兔耳软骨取得了较好的效果。故本实验设想探讨一下未分化的ADSCs复合PRF在体内修复活动性的髁状突软骨缺失是否具有可行性。【目的】探索非诱导ADSCs膜片复合PRF植入兔下颌骨髁状突软骨缺损处观察其修复效果。为治疗髁状突软骨缺损找到新方法,为临床病人解决难题。【方法】1、从家兔背部获取脂肪组织,胰蛋白酶消化后离心获得ADSCs。然后通过细胞的生长表型,成骨与成脂能力的测定,细胞表面相应抗原的检测。来证明获得的细胞就是脂肪间充质干细胞。证明后通过加入抗坏血酸将细胞诱导培养成细胞膜片,为下一步的实验奠定基础。2、从家兔耳缘中动脉采集血液,高速离心后获得PRF胶体,冻干制成粉剂备用。3、建立实验的动物模型。通过手术的方法暴露家兔髁状突关节面,使用裂钻制造一直径3mm、深度3mm累积软骨下骨的缺损。4、将36只雄性新西兰大白兔随机分为3组:空白组、PRF组、ADSCs膜片复合PRF组,每组12只。都按建立动物模型的方法制造软骨缺损。缺损建立后,空白组不植入任何东西;PRF组植入PRF材料;ADSCs膜片复合PRF组植入异体ADSCs膜片与PRF的复合物。术后1月、2月、3月取材,通过标本大体观察及组织学染色的结果来确定软骨缺损的修复情况。5、采集每一只实验动物术前及术后7d、14d、30d的血液,检测其中的CD4、CD8、IL-2、IL-4的水平来检测异体ADSCs移植是否产生了免疫排斥反应。6、统计学方法。数据通过SPSS17进行分析,数据以均数±标准差(X±SD)表示,多样本均数比较采用方差分析,两样本均数的比较采用SNK-q法,检验水准α值取双侧0.05。【结果】1、分离的ADSCs在培养皿里呈集落样漩涡状生长,HE染色中核蓝染、胞浆红染。ADSCs体外成功的诱导成了脂肪细胞和骨细胞,表面抗原的流式检测结果为CD29、CD44为高表达,CD31、CD34、CD45低表达。这些都复合ADSCs的特点。2、在空白组髁状突缺损模型建立后的1月、2月、3月各时间点的标本进行肉眼观及组织学染色分析,其结果都表面人为造成的软骨缺损处几乎没有修复软骨组织的形成,这说明了实验模型的建立是成功的。3、移植后的修复情况。肉眼观与组织学染色的结果都显示:空白组在术后的各个时间点软骨缺损区都没有修复的软骨组织形成,随着时间的延长缺损底部有新生的骨组织。同时有少量的软骨细胞向新生的骨表面爬行。在PRF组中,术后未见明显的新生软骨组织,缺损两端仅见少部分正常软骨爬行形成的软骨组织缺损明显。而在ADSCs膜片复合PRF组中在第一个月时见缺损底部有一薄层白色软骨组织形成,在组织学染色中其细胞排列不如正常软骨规则色稍淡。在术后2月时新生的软骨组织就已基本填满缺损,有的地方在与正常组织交接的地方还有微小的间隙。术后3月时肉眼下新生组织表面光滑且固有组织的交接处变得更模糊,需仔细辨认方能发现,组织学切片中修复的软骨组织更为紧凑单位体积内软骨细胞的密度更大,新生软骨组织与骨组织交接的地方出现了部分纤维化和骨化。Image pro-Plus6.0分析得出,缺损修复术后3月,空白组修复率是(1.32±0.23)%,PRF组是(10.37±0.76)%、ADSCs膜片复合PRF组是(87.25±4.12)%,进行两两比较方差分析,各组间两两比较均有统计学差异(P<0.01)。就可以得出这样的结论:PRF有促进软骨组织形成的作用,但在这种极限缺损范围内的缺损光有PRF还是不够的还需要种子细胞;实验组较好的修复效果说明了未分化ADSCs膜片复合PRF修复髁状突这种功能性软骨缺损是可行的。4、各实验组的动物在术前与术后7d、14d、30d测量的CD4和CD8细胞、IL-2、IL-4因子的水平以及计算出来的CD4/CD8值,经完全随机设计方差分析得出各实验组在组内及组间均无统计学意义(P>0.05)。在高倍镜下观察HE切片未发现免疫细胞浸润。这就说明异体ADSCs未使机体产生排异反应。【结论】1、从脂肪组织中获得的细胞就是ADSCs,体外分裂能力强。培养过程简单。只需加入一定量的抗坏血酸就能将其诱导培养成细胞膜片,这样细胞的数量成倍的增多,胞外基质和细胞形成了一三维立体网状结构细胞稳定性好不易流失。适合组织缺损的修复。2、PRF储备量大,易提取。含细胞因子能促进软骨组织的形成。异体ADSCs膜片复合PRF对髁状突这种功能性软骨缺损具有较好的修复作用。同时异体ADSCs免疫原性低移植不引起排斥反应。