论文部分内容阅读
磷脂酰肌醇在大多数真核生物中有至关重要的地位,行使着多样化的细胞功能,它们可以通过不同的磷脂酰肌醇激酶和磷酸酶实现异构的转化。PI(3,5)P2在细胞稳态和适应性方面起到了信号分子的作用,它的抑制会影响正常的内吞/溶酶体功能。PIKfyve是哺乳动物中唯一催化PI3P生成PI(3,5)P2的脂类激酶,在体内行使多项调控功能,如调控外体的释放,调控内吞途径,在肿瘤细胞中还能调控细胞的侵袭和迁移等。之前已有研究报道过数种PIKfyve的小分子抑制剂,如YM-201636、MF4、阿吡莫德、APY0201等,都在不同的细胞系中表现出了对PIKfyve的抑制作用。但已知的小分子抑制剂仍存在对激酶的选择性差、作用细胞单一等缺点,因此新颖、高效、专一的PIKfyve抑制剂仍亟待发现。在本论文研究中,我们通过细胞表型筛选结合后期的KINOMEscan平台及其他细胞及分子生物学手段筛选出了一个PIKfyve的小分子抑制剂HW-05-131-01。实验结果表明:在乳腺癌细胞MDA-MB-231中,HW-05-131-01时间和浓度依赖性抑制PIKfyve功能,导致细胞空泡化。同时,还发现寡营养条件不利于细胞在加药后产生空泡化,L-谷氨酰胺和L-苏氨酸的补充能在一定程度上恢复空泡化,低氧和无糖的培养条件对细胞产生空泡化效应并无影响。尽管短时间的加药不会引起细胞死亡,但是长时间的加药会一定程度地影响细胞生存。进一步通过一系列免疫荧光实验表明,HW-05-131-01很可能通过阻滞内吞膜运输途径,影响溶酶体降解的进程。综上所述,本论文研究工作发现了一个新型的PIKfyve小分子抑制剂HW-05-131-01,并对其培养的细胞条件、引起细胞死亡的方式以及对内吞膜运输途径的影响进行了初步探讨,为发展以PIKfyve为靶点的抗癌药物提供了先导化合物,也为进一步研究PIKfyve抑制机理提供了理论基础。