研究背景及目的氟中毒(Fluorosis)是一种慢性全身性疾病，是由于长期生活在高氟环境中通过饮水、食物和空气而摄入过量的氟，导致人体中氟元素蓄积。微量元素氟对人体健康的影响有其特殊性，适量时可以有效促进骨质生长、降低龋病的发病率，过量时则引起氟中毒，使机体引起骨相和非骨相损害，从而引起氟斑牙、氟骨症等牙齿和骨骼的病变，同时还能引起中枢神经系统、肝、肾以及内分泌系统等多种器官的病理变化，但由于氟对骨组织具有特殊的亲和力，使氟对骨相的损害较非骨相的损害更为敏感。氟引起的骨相损害中，氟斑牙是氟中毒最早出现、最显而易见的特异性体征，严重损害牙齿的正常功能，又影响美观。氟斑牙的病理变化复杂多样，其形成是由于牙齿在矿化期阶段，持续摄入过量的氟而引起的，但氟斑牙发病的具体分子生物学机制尚未充分阐明。牙器官形成过程与成釉细胞密切相关，成釉细胞是对氟中毒最敏感的细胞，大量的研究提出氟斑牙形成的可能致病途径是由于氟干扰成釉细胞的增殖、分化，加剧成釉细胞的凋亡；干扰成釉细胞中釉基质的合成、分泌及移除。因此，成釉细胞是研究氟斑牙发病机制的重要研究对象，也是关键突破口。本实验室曾通过建立氟斑牙的大鼠实验动物模型，研究了氟对大鼠切牙成釉细胞凋亡、DNA损伤以及Fas表达的影响，但是成釉细胞如何在氟的毒理学作用下形成以氟斑牙为主要表现的氟骨相损害，其机制仍需深入探讨。近年来，在分子水平上广泛研究了氟与氧化应激和细胞凋亡的关系，氟中毒的损伤作用主要是通过对机体产生氧化应激引起，而细胞凋亡在牙齿发育中起着重要作用，是导致氟对牙齿损害的关键因素之一。在细胞生长发育以及对外界刺激的反应中细胞凋亡贯穿整个生物学发展过程，而氧化应激又是凋亡发生的中心环节，是氟中毒诱导细胞凋亡的关键。新近的研究发现，作为核转录因子的NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)和其胞质接头蛋白Keap1(Kelch-likeECH-associated protein1，Keap1)是细胞抗氧化应激的中枢调节者，在抗氧化应激方面起着关键作用。在机体受到氧化应激损伤时，转录因子Nrf2能够和抗氧化反应元件(Antioxidant response element，ARE)结合，对Nrf2下游存在的一系列的Ⅱ相解毒酶基因，如血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化还原酶1(NAD(P)H dehydrogenase quinone1，NQO1)等抗氧化酶基因进行调控及诱导，从而增强机体的抗氧化应激能力。本研究利用体外培养小鼠成釉细胞株，以氟引起小鼠成釉细胞氧化损伤为基础，开展氟对氧化应激、DNA损伤、细胞增殖与凋亡以及对Nrf2信号通路的作用研究。检测氟对成釉细胞氧化应激，DNA损伤，Nrf2、HO-1、NQO1的基因和Nrf2蛋白的表达，细胞增殖与凋亡的影响，探讨Nrf2信号通路在氟致成釉细胞损害中的作用，从而为深入研究氟斑牙发病机制提供新的实验证据。既然氧化应激被普遍认为是氟中毒的重要机理，因此，探讨抗氧化剂的抗氧化作用在氟中毒防治中是至关重要的。本课题还将研究以枸杞多糖、原花青素、硒、锌为代表的抗氧化剂对氟诱导成釉细胞DNA损伤的保护作用，探索氟中毒的防治措施。本研究主要由以下3部分组成：第一部分：氟对小鼠成釉细胞氧化应激、细胞增殖与凋亡的作用研究目的：探讨氟对小鼠成釉细胞存活率的影响，确定后续实验的氟染毒剂量。观察不同剂量的氟对小鼠成釉细胞氧化应激、DNA损伤、细胞周期和凋亡的影响。方法：建立并改良小鼠成釉细胞株的培养方法，应用四唑盐(MTT)比色法，观察氟对培养的成釉细胞增殖活力的影响；测定小鼠成釉细胞丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性；用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和酶联免疫实验(ELISA)检测氟对成釉细胞DNA的损伤；用流式细胞术(FCM)检测氟对成釉细胞的细胞周期变化及凋亡的改变。结果：改良后细胞培养方法重复性好，成釉细胞生长稳定，纯化效果好，完全适合建立氟中毒的体外模型。氟对成釉细胞有一定的细胞毒性，随着染氟剂量的升高，细胞的存活率逐渐降低，SOD的活性逐渐下降，GSH-Px的活性被抑制，MDA含量增加；DNA损伤结果显示，除染氟剂量为0.25mmol/L时，随着染氟剂量的升高，各剂量组氟造成的细胞DNA彗星样尾长、Olive尾距、尾DNA%及尾/头长比与对照组相比均明显增加。其中尾长、Olive尾距在0.50、1.00、4.00mmol/L染氟剂量时与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。除染氟剂量为2.00mmol/L外，其他组随着染氟剂量的升高，8-OHdG含量逐渐升高，其中在染氟剂量为0.50，1.00，4.00mmol/L时，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。染氟剂量为2.00mmol/L时，与对照组比较，小鼠成釉细胞G0/G1细胞构成比升高，G2/M细胞构成比升高，S期细胞构成比下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余各组小鼠成釉细胞G0/G1、G2/M、S期细胞构成比与对照组比较，差异无统计学意义。小鼠成釉细胞的凋亡率在染氟剂量为4.00mmol/L时，与对照组相比，凋亡率升高(P<0.05)。结论：氟在一定剂量条件下抑制小鼠成釉细胞的增殖，过量氟能使小鼠成釉细胞处于氧化应激状态，同时导致成釉细胞DNA损伤，一定剂量的氟使细胞停滞于S期，降低细胞活力，改变细胞周期的分布，并诱导细胞凋亡。第二部分：氟对小鼠成釉细胞Nrf2信号通路的影响目的：在基因转录、翻译和蛋白表达水平，观察不同剂量的氟处理和特丁基对苯二酚(Tertiary butylhydroquinone，tBHQ)诱导后成釉细胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA和Nrf2蛋白的表达水平，探讨Nrf2信号通路和tBHQ对氟诱导的成釉细胞毒性的作用。方法：RT-PCR法测定成釉细胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA的表达；Western-Blot法测定成釉细胞Nrf2蛋白含量。结果：单独染氟组，成釉细胞内Nrf2mRNA和Nrf2蛋白表达随氟剂量的升高逐渐增强。只有1.00和4.00mmol/L染氟组细胞内Nrf2mRNA表达与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；各染氟组HO-1mRNA表达都比对照组高，只有在0.50、1.00、2.00和4.00mmol/L剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。除在4.00mmol/L剂量组外，其余染氟组NQO1mRNA表达量都比对照组高，但只有在1.00mmol/L剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。在0.25、2.00mmol/L染氟剂量组，细胞浆内Nrf2蛋白与对照组相比表达有所增加(P<0.05)。细胞核内Nrf2蛋白在2.00、4.00mmol/L染氟剂量时表达上调(P<0.05)。经tBHQ预处理后，各组Nrf2、HO-1、NQO1mRNA和细胞浆、细胞核中Nrf2蛋白表达与同剂量染氟tBHQ未处理组相比均升高。在0.00、0.25、0.50、2.00、4.00mmol/L染氟剂量，Nrf2mRNA与同剂量染氟tBHQ未处理组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组HO-1mRNA表达都比同剂量染氟tBHQ未处理组高，只有在0.00、0.50、和4.00mmol/L染氟组差异有统计学意义(P<0.05)。各组NQO1mRNA表达都比同剂量染氟tBHQ未处理组高，只有在0.25、4.00mmol/L染氟组差异有统计学意义(P<0.05)。在染氟剂量为0.25、1.00、2.00、4.00mmol/L时，tBHQ处理组核浆内Nrf2蛋白比值与tBHQ处理对照组(0.00mmol/L NaF)相比差异有统计学意义(P<0.05)，且呈升高趋势。在染氟剂量为0.00、0.50、4.00mmol/L时，tBHQ处理组与tBHQ未处理组核浆内Nrf2蛋白比值相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：一定剂量的氟作用成釉细胞后可诱导Nrf2基因和蛋白的表达，进而使Nrf2信号通路下游II相抗氧化酶基因HO-1和NQO1表达增加；tBHQ可诱导成釉细胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA的表达增强，能够在一定程度上拮抗氟对成釉细胞的毒性作用，对细胞具有保护作用。第三部分：抗氧化剂对氟致小鼠成釉细胞DNA损伤的研究目的：研究枸杞多糖、原花青素、硒、锌分别与氟联合作用对小鼠成釉细胞DNA损伤的影响。方法：成釉细胞贴壁培养24h后换液并加入不同剂量的抗氧化剂：枸杞多糖(100mg/L、200mg/L、400mg/L)、原花青素(10mg/L、25mg/L、50mg/L)、亚硒酸钠(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、硫酸锌(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)，处理相应时间后换液，加入不同剂量的氟处理细胞，然后收集细胞采用单细胞凝胶电泳技术检测DNA单链断裂。结果：枸杞多糖、原花青素、硒、锌各处理组的Olive尾距与同剂量单独染氟组比较差异有统计学差异(P<0.05)，且均低于对照组。染氟剂量为0.25，0.50，2.00，4mmol/L，400mg/L枸杞多糖处理组比100mg/L、200mg/L枸杞多糖处理组的Olive尾距小(P<0.05)；染氟剂量为0.00，0.25，0.50，1.00mmol/L，10mg/L原花青素组比25mg/L、50mg/L原花青素处理组的Olive尾距小(P<0.05)，但是随着染氟剂量的升高，25mg/L、50mg/L原花青素组比10mg原花青素处理组的Olive尾距小(P<0.05)；染氟剂量为0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00mmol/L，2.5μmol/L硒处理组比5μmol/L、10μmol/L硒处理组的Olive尾距小(P<0.05)；染氟剂量为0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00mmol/L，10μmol/L锌处理组比5μmol/L，20μmol/L锌处理组的Olive尾距小(P<0.05)。结论：枸杞多糖、原花青素、硒、锌在一定剂量范围内可有效拮抗过量氟导致的DNA的损伤作用，对氟中毒小鼠成釉细胞有明显的保护作用。