狗牙根应答干旱、盐和水淹胁迫机制的比较研究

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随着全球性气候异常和生态平衡的破坏,土壤沙漠化和盐碱化日趋严重。研究干旱、盐、水淹胁迫对植物的伤害及植物对这三种非生物胁迫的适应和调节机制,并进而利用生物工程的手段来提高植物对这三种非生物胁迫的抗性,是一项迫切的任务。目前,对于狗牙根抗性的研究主要集中在生理生化方面,而分子水平的研究较少。本课题以狗牙根为主要研究对象,借助组学的手段,开展了以下四个方面的工作:一、狗牙根不同品种在干旱胁迫前后的蛋白组学的比较研究;二、狗牙根在不同逆境胁迫下(干旱、盐和水淹)蛋白组学的比较研究;三、狗牙根在上述三种非生物逆境胁迫处理前后代谢组学的比较研究;四、利用转录组测序等手段,比较狗牙根在上述胁迫处理前后转录组水平的变化,并对感兴趣的差异表达基因进行功能分析。通过上述转录组、代谢组以及蛋白组学的分析方法,系统研究了不同品种狗牙根应答干旱胁迫的差异性以及同一品种狗牙根应答不同非生物逆境胁迫的特异性,并对挑选的差异表达基因进行了功能验证。主要研究内容及结论如下:  (1)以干旱敏感型‘Yukon’和干旱耐受型‘Tifgreen’两个狗牙根品种为材料进行了不同狗牙根品种应答干旱胁迫的蛋白质组的研究。在干旱胁迫情况下对两个品种叶片和茎的细胞损伤程度进行比较,发现不同品种之间以及不同器官之间存在差异。利用蛋白组学分析手段分别对‘Yukon’和‘Tifgreen’的叶片和茎中的总蛋白进行了定性和定量分析,鉴定了39个显著变化的蛋白,其中有3个共上调,2个共下调和2个不同表达趋势的蛋白。另外,有23个差异表达蛋白在‘Yukon’中上调,在‘Tifgreen’中组成性表达,3个表现出不同的表达趋势。这些蛋白主要富集在光合作用、糖酵解、氮代谢、TCA和氧化还原途径中。  (2)在比较狗牙根对干旱和盐胁迫应答机制的研究中,以‘Yukon’为材料,生理结果表明,干旱和盐胁迫导致渗透物质大量积累,ROS水平升高,抗氧化酶活性增强。通过比较蛋白质组学结果发现,在干旱和盐胁迫后共成功鉴定到77个差异表达的蛋白,这些蛋白主要富集在光合作用、氧化磷酸戊糖途径、糖酵解和氧化还原代谢路径中。其中,有36个蛋白受到两种胁迫的共调控,分别有12个蛋白受到干旱或盐胁迫的特异性调控。共15个蛋白参与了碳代谢路径。另外,胁迫前后共成功检测到37种代谢物,包括氨基酸、有机酸、糖、糖醇等。其中18种代谢产物参与了碳和氨基酸代谢途径。与盐胁迫相比,干旱胁迫导致较低的糖和糖醇的积累,更高的ROS水平,从而导致更严重的细胞膜损伤和更低的存活率。  (3)在狗牙根应答干旱和水淹胁迫的比较研究中,以‘Yukon’为材料,在干旱胁迫后,相容性物质含量,ROS(Reactive oxygen species)水平和抗氧化酶活性都发生了显著的变化,而在水淹条件下上述变化则不显著。通过MALDI-TOF-MS蛋白质组学分析表明,共鉴定了81个差异表达的蛋白。其中,有76个蛋白在干旱胁迫后显著变化,分别有46个蛋白的丰度显著上调和30个蛋白的丰度显著下调。80%成功鉴定的蛋白丰度在水淹条件下发生显著变化,其中10个蛋白丰度显著增加,35个蛋白丰度显著降低。路径富集分析表明,虽然氨基酸代谢路径和线粒体电子转移/ATP合成路径只有干旱胁迫后差异表达的蛋白富集其中,但是包括光合作用、外源性物质的降解、氧化磷酸戊糖途径和氧化还原路径是干旱和水淹胁迫后差异表达蛋白的主要富集路径。进一步分析表明有14个蛋白参与了光合生物的碳固定路径。这些结果表明干旱和水淹胁迫都影响了狗牙根体内的光合作用和氧化还原路径。代谢组学分析表明,在干旱胁迫下,大部分检测到的代谢物含量都有所增加,而水淹胁迫后,检测到的40种代谢物中,有34种含量都表现为下降或不变趋势,主要包括糖和糖醇。这些结果表明,干旱胁迫显著增强狗牙根的光合作用和氧化还原代谢,狗牙根可能采取降低代谢速率以及休眠的策略来应对水淹胁迫。  (4)在狗牙根胁迫抗性相关基因的克隆和功能分析中,通过比较狗牙根胁迫处理前后转录水平的变化,我们挑选并成功的克隆了拟南芥AtPYL8同源基因,我们将其命名为CdPYL8,接下我们对该基因的功能进行了进一步分析,首先对这个基因进行了亚细胞定位,发现细胞膜、细胞核和细胞质都有定位。然后我们进一步对CdPYL8在ABA信号途径中的作用进行了进一步验证。我们用原生质体转化的方法重构了ABA信号通路,并且利用酵母双杂交实验进一步验证了CdPYL8确实与AtABI1存在相互作用,该实验结果表明CdPYL8确实具有ABA受体的功能。
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