卵巢癌是导致美国妇女死亡第五位的妇科恶性肿瘤。卵巢癌致死性高的原因主要在于首次诊断即为晚期,病灶扩散至卵巢外,尽管手术后化疗可以取得较好的效果,但是只有30%患者在首次诊断后存活5年。目前卵巢癌面临的主要问题是缺乏早期诊断手段以及晚期远处转移并伴有化疗耐药。所以快速准确的早期诊断手段以及晚期有效安全的治疗策略是卵巢癌治疗的关键。肿瘤的发生及发展由遗传学和表观遗传学共同决定。与遗传学不同的是,表观遗传学具有可逆性并能使细胞转换到正常状态,表观遗传调控网络的破坏可能是导致疾病的重要机制,包括染色体不稳定性引起的相关综合征以及精神发育迟缓等。通过对表观遗传学相关酶类位点药物研究发现,在表观遗传调控中,将表观遗传修饰改变作为治疗方法将和化疗一样成为肿瘤防治的重要手段。目前新的检测方法的发展对解释表观遗传改变引起的疾病提供了重要依据。随着表观遗传药物在治疗疾病过程中所发挥的作用,原来越多的表观修饰抑制剂的作用机理得到深入研究,特别是DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶以及组蛋白去甲基化酶抑制剂。也有研究发现表观遗传药物对恶性肿瘤具有较好的抗肿瘤作用,我们推测传统化疗药物联合表观遗传药物可以改善卵巢癌细胞的生物学行为,我们希望通过对卵巢癌细胞表观遗传修饰表达方式的研究,探讨联合用药和序贯用药的方法是否对卵巢癌分子生物学、细胞生物学、形态学及致瘤能力产生影响,以期为寻求新的卵巢癌治疗策略提供依据,从而达到有效抑制肿瘤生长的目的。第一章表观遗传药物联合化疗药物对卵巢癌细胞株影响目的：通过表观遗传修饰药物及传统化疗药物对卵巢癌转移灶及腹水肿瘤细胞株生物学功能、表观遗传修饰、Spheroid形成的分析,试图寻找卵巢癌转移部位肿瘤对表观遗传修饰药物的反应,通过对表观遗传修饰规律的发现,为进一步改善传统化疗药物治疗效果,尤其是为有效腹水肿瘤及转移部位肿瘤的治疗提供依据。方法：1细胞准备及蛋白提取1.1药物处理的细胞蛋白酶消化后,细胞转移到15ml离心管,将细胞用PBS冲洗一遍在1000转/分钟条件下离心5分钟,待提蛋白。1.2总蛋白提取方案：准备1x提取液并将1ml提取液加入到4ml蒸馏水中,加入DTT溶液,并使DTT与提取液的比例为1：1000,将106粘附细胞重悬浮的细胞放入到100ul的冰冷1x提取液中,将含有细胞的溶液转移到1ml离心管中,冰上放置15分钟,并且每5分钟摇晃5秒,4-C条件下14000转/分钟离心细胞溶液10分钟,并将上清液转移到新的1ml离心管中,细胞蛋白提取液定量,将提取的细胞裂解液放置到-80℃冰箱备用。1.3组蛋白提取方案：将细胞收取并在1000转/分钟4℃条件下离心5分钟,用蒸馏水将10x预裂解液稀释成1x,将106细胞重新悬浮在裂解液中放置在冰上10分钟,该过程中轻轻摇晃,然后在3000转4℃条件下离心5分钟,如果细胞裂解液的体积为1.5-2ml则需要在10,000转/分钟4℃条件下离心1分钟并丢弃上清液。将200ul的裂解液加入到含有离心沉淀的离心管中并在冰上放置30分钟,将离心管在12,000转/分钟4℃条件下放置5分钟,并将上清液转移到新的离心管中,准备DTT平衡溶液,将DTT溶液以1：500的比例配制(0.3mlDTT平衡液加入到1ml上清液中),用OD值进行蛋白定量,BSA作为标准对照,将获取的组蛋白提取液放置到-20℃中保存数天或者在-80℃中长期保存,避免反复冻融和冷冻。1.4核蛋白提取方案：细胞消化待提取,按照1：20(例如3mlPBS加入到100mm培养板中)的比例将新鲜PBS加入到培养板中,将细胞刮掉并放置到15ml离心管中,在1000转/分钟条件下离心5分钟并丢弃上清液,将NE1溶液用水按照1：10比例稀释,将DTT和PIC以1：1000的比例加入到冰冷稀释1XNE1液中,将细胞按照106每100ul稀释NE1液的比例混合并转移到新的1ml离心管中,将离心管在冰上放置10分钟,每2分钟震荡10秒,随后在12,000转/分钟下离心1分钟,将细胞浆小心与细胞核沉淀分离,将DTT和PIC以1：1000的比例与NE2溶液混合,将2体积的含有DTT和PIC的NE2溶液加入到沉淀物中,将提取物在冰上放置15分钟并每3分钟震荡5秒,细胞提取物随后超声3x10秒为了增加核蛋白的提取效率,将提取液在14,000转4℃条件下离心10分钟,并将上清液转移到新的离心管中,对核蛋白进行定量,将提取液迅速的冷冻到-80℃冰箱中,避免反复冻融。2 Western Blotting2.1配胶：将灌胶架放置到试验台中,保持水平,将两块玻璃板放置到灌胶架中,保持短板面朝外,保证两块玻璃板在同一水平位置,将两块玻璃压紧,以保持密闭性,调整灌胶架以及玻璃板的位置,保持灌胶过程中胶在玻璃板中的位置适当,同时对玻璃板与低端橡胶带的衔接紧密。保持灌胶梳顺利插入到两块玻璃板之间,同时保持灌胶梳位置的正确。将分离胶加入到两块玻璃之间,在加入分离胶的过程中保持操作正确,用吸管将胶液缓慢的加入到两者之间,同时保持加入分离胶的量在合适的位置,加入500ul蒸馏水并放置45分钟,当分离胶凝固后,将蒸馏水用吸水纸洗掉,按照配方配制浓缩胶,将浓缩胶缓缓加入到分离胶上面并放置灌胶梳,待10分钟后将配好的胶移出并放置到电极装置中。2.2电泳：将凝胶板按照电极装置说明放置,将凝胶板放置妥当后加入1X电泳缓冲液,将内部核心槽放置后加入400ml电泳缓冲液,按照测量的浓度将样品调整浓度,以保持样品蛋白含量相同,对于全细胞蛋白需要50-100ug,而核蛋白需要20-50ug,组蛋白需要50-100ug。根据试验需要将蛋白样品与6xSDS样品缓冲液液或者2xLaemmli混合,蛋白电泳标记物选择全蓝标记分子,需要体积为5u1,将需要电泳的样品在95-100℃中放置3分钟,将样品迅速旋转并加样,一旦胶发生凝固后即从灌胶架上移除并放置到电泳装置中,将电泳装置内室加入1x电泳缓冲液,同时将外室中加入1x电泳缓冲液,移除灌胶梳并加样,并在75v电压下保持1-2小时。2.3转膜：根据具体实验条件调整,在胶电用完之前,准备好转膜缓冲液,同时在转膜之前5分钟,每块胶准备好2片滤纸和纤维纸,将需纤维素膜提前5分钟浸入到转膜缓冲液中,停止电泳并开始转膜,将胶板从电泳装置中移除,将两块玻璃板分离,将带有胶的玻璃板平稳放置到转膜缓冲液中,慢慢将胶从玻璃板上移除,在转膜缓冲液中放置10分钟将转膜架的黑色面朝下,放置顺序分别为：纤维纸垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维纸垫。如果装置松散则可以增加滤纸以保持无气泡。将转膜架压紧并放置到转膜槽中,黑对黑,加入冰冻转膜缓冲液,转膜槽加满缓冲液。载电压30V 4℃过夜或者220V室温下1小时,保持整个过程处于冷冻状态。将转膜架打开,将膜平整的放置到干净容皿中,用清水冲洗2-4次,50ml封闭(5%无脂牛奶TBS-T溶液)液室温下封闭1小时,常温下TBST冲洗3次10分钟,加入一抗常温下孵育1小时或者4℃过夜。2.4检测：常温下TBST冲洗3次10分钟,加入二抗常温下孵育1小时或者4℃过夜,常温下TBST冲洗3次10分钟,将膜上液体吸干放置到保鲜膜上,加入3ml显色剂,并孵育1分钟将显色剂去除,放置到保鲜膜中,随后放置到G:Box装置进行检测,图像获取及数据整理。3 Spheroid形成试验将细胞消化计数后按照500细胞/ml的浓度稀释在DMEM/Ham’s F-12培养基中,然后根据要求将细胞稀释到Spheroid培养基Complete MammoCult TM Medium中并种植到低粘附培养板中,放置到37℃培养箱中培养,定期观察并拍照,所有Spheroid试验处理过程严格按照实验设计,根据不同的时间点进行图像拍摄,并在实验各个时间点获取Spheroid进行相关的细胞计数以及活性检测试验。结果：1药物处理对卵巢癌肿瘤生物学影响卵巢癌细胞株Hey中无E-cadherin表达而N-cadherin强表达,Trichostatin A、Decitabine及Cisplatin单独处理可以轻度增加N-cadherin的表达,而不能增加E-cadherin的表达。Trichostatin A/Cispaltin组合及Decitabine/Cispaltin组合并不能改变N-cadherin的表达。所有药物处理组合对Pan-AKT及AKT-1无显著影响,表明可能通过其他非AKT信号通路影响细胞,Trichostatin A, Decitabine及Cisplatin单独应用及Trichostatin A/cisplatin联合用药对ABCG2表达无影响。decitabine/Cisplatin可以显著的抑制ABCG2的表达。干细胞标志分子OCT4在Hey中强表达,而NANOG和SOX2中度表达,药物处理无显著影响,凋亡蛋白分析结果显示单独应用Trichostatin A, Decitabine和Cisplatin可以显著提高Bax的表达。SKOV3中强表达E-cadherin,而N-cadherin表达较弱。单独应用Trichostatin A、Decitabine以及Cisplatin对E-cadherin及N-cadherin无显著影响,而联合用药TSA/Cisplatin, Decitabine/Cisplatin可以显著降低E-cadherin及N-cadherin的表达。单独应用药物Decitabine或者Trichostatin A可以激活AKT的表达,联合用药能够明显抑制AKT-1的表达Pan-AKT表达无显著改变。所有处理组均能够抑制ABCG2的表达。NANOG的表达在Decitabine/Cisplatin的作用下受到明显抑制,SOX2受到组合用药Trichostatin A/Cisplatin及Decitabine/Cisplatin抑制作用显著,且表达明显降低,这种现象在OCT4中也观察到。线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2,Bcl-xl以及Bad无显著改变,TSA,Decitabine以及Cisplatin抑制Bax的表达,TSA/CSP和decitabine/CSP对Bax具有完全抑制作用。2药物处理对卵巢癌细胞表观遗传学影响DNMT3a和DNMT3b均在Hey细胞中表达。Cisplatin可以升高DNMT3a的表达。DNMT3b表达在处理前后无显著改变。结果显示所有处理对LSD1无影响。组蛋白甲基化进行分析结果显示药物处理对H3K4me2、H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3无显著影响。SKOV3细胞中DNMT3a强表达而DNMT3b表达较弱。Trichostatin A, Decitabine以及Cisplatin能够抑制DNMT3a的表达,而Decitabine/Cisplatin的抑制效果更为显著,Trichostatin A/Cisplatin抑制效果处于两者之间。Trichostatin A/Cisplatin, Decitabine/Cisplatin可以明显抑制LSD1的表达,这与Hey细胞存在较大的差异。Trichostatin A/Cisplatin可以显著降低H3K4me2和H3K4me3的水平,Trichostatin A/Ccisplatin可以完全抑制H3K9me3的表达,Decitabine/Cisplatin轻度抑制H3K9me2,药物单独应用呈现出不同的表达方式。Trichostatin A, Decitabine及Cisplatin对H3K4rne2无明显影响,而Trichostatin A和Decitabine对H3K4me3轻度抑制。此外,单独用药及Decitabine/Cisplatin对H3K9me3也有较为明显的抑制作用。3药物处理对卵巢癌细胞Spheroid形成的影响Hey形成的Spheroid体积较大并且较为紧密。IOSE形成的Spheroid体积较大。SKOV3形成Spheroid较Hey Spheroid在细胞数目和体积都小,A2780形成的Spheroid不规则并且较为松散。Spheroid对药物的反应具有浓度和时间依赖性,药物组合Trichostatin A/Cisplatin, Decitabine/Cisplatin均能完全抑制Spheroid的形成,Spheroid形成后然后再用药物处理结果显示单药物应用不能抑制Spheroid的生长,而高剂量Cisplatin和Trichostatin A/Cisplatin, Decitabine/C isplatin显著抑制Spheroid的生长。Spheroid形成数目具有药物种类和浓度依赖性。TSA/Cisplatin组合可以获得与高浓度TSA及Cisplatin相同抑制效果。而在SKOV3细胞中,对照组相比,所有组别Spheroid在第5天无显著差异,随着培养天数的增加,TSA, Decitabine及Cisplatin处理组Spheroid生长受到完全抑制,细胞活性检测发现细胞全部发生凋亡。联合用药Trichostatin A/Cisplatin和Decitabine/Cisplatin组与单药处理类似,所有Spheriod形成及细胞活性受到完全抑制。在Spheroid生长抑制实验过程中,研究结果显示TrichostatinA组、Cisplatin5um组以及Trichostatin A/Cisplatin组完全抑制Spheroid的生长及细胞活性,而Decitabine组、Cisplatin低剂量组和Decitabine/Cisplatin组对Spheroid的生长无显著影响。这表明腹水肿瘤细胞团对TSA的反应同高剂量Cisplatin同样敏感。联合用药可以显著减少Spheroid形成数目,且SKOV3细胞Spheroid数目分析发现具有药物种类和浓度特异性。三种药物Trichostatin A, Decitabine和Cisplatin对Spheroid的抑制作用随着药物浓度的增加而增强。与对照组相比,药物组合Trichostatin A/Cisplatin可以使Spheroid形成降低8倍,而Decitabine/Cisplatin组只有5倍。更为有趣的是,Trichostatin A/Cisplatin组合可以获得与高浓度Cisplatin相似效果,这种联合应用的优点同Hey相似。结论：Hey细胞强表达N-cadherin且药物处理可以改变N-cadherin的表达。药物处理对ABCG2的影响最为显著,强表达多能性标志分子OCT4/NANOG/SOX2。DNMT及LSD1的表达无显著变化。药物Trichostatin A/CSP组合抑制Spheroid形成及生长能力显著,选择合适的抑制Spheroid形成能力的药物组合可能可以阻止肿瘤的转移而最大保护正常卵巢上皮细胞。与Hey细胞相比,在SKOV3细胞中联合用药较单独用药显著抑制E-cadherin及N-cadherin的表达,所有处理组都可以抑制ABCG2的表达,强表达OCT/NANOG/SOX2,而对线粒体凋亡相关蛋白无显著影响,高表达DNMT3a,而DNMT3b表达较弱,药物处理中联合用药对DNMT3a的效果较单独用药更为显著,联合用药可以显著抑制肿瘤LSD1的表达,而LSD1可以促进组蛋白的去甲基化,这就表明在DNA甲基化、组蛋白修饰以及DNA损伤机制方面存在相互联系,Trichostatin A/Cisplatin联合用药较单独用药可以显著抑制H3K4和H3K9甲基化表达水平,单独药物及联合用药都能完全抑制spheroid的形成,Trichostatin A/CSP单独或者联合用药都能够显著抑制Spheroid的生长。第二章表观遗传药物联合化疗药物对卵巢癌细胞致瘤能力影响目的：依据上述实验结果并通过对临床病例的观察,建立卵巢癌动物模型,通过表观遗传修饰药物、传统化疗药物和联合用药疗法及序贯疗法对卵巢癌细胞肿瘤形成、生长以及腹腔内转移进行的分析,阐述表观遗传药物联合传统化疗药物对卵巢癌的抗肿瘤的效果。方法：1肿瘤细胞的准备将肿瘤细胞hey种植到培养板中,当细胞生长到培养皿面积的70-80%时,用PBS冲洗去2遍,去除漂浮的细胞,加入蛋白酶-EDTA消化,将获取的细胞在1500转/分钟条件下离心2-5分钟并用PBS冲洗两次,随后用计数板对细胞进行计数,用台盼蓝检测细胞活性。将细胞悬浮到培养基中准备接种。2老鼠准备4-6周龄老鼠,在试验前3天运抵。3实验过程、后续观察及试验记录根据实验需要,将10x106肿瘤细胞或者与处理过的肿瘤细胞皮下注射或腹腔注射,注射过程前做好准备工作,包括老鼠状态的观察体重的测量等基本情况记录,在实验过程中注意操作并做好标记,肿瘤种植过程后,密切观察动物反应,待肿瘤接种后第2天再次探望。将动物的状态做好详细记录,每天观察一次,对于状态不佳老鼠增加观察次数,带肿瘤形成后根据要求测量肿瘤大小以及动物荷瘤体重。对于序贯治疗老鼠,根据研究设计进行严格操作,以保证数据的客观性和可靠性。4实验结束时,麻醉处死、记录观察、测量数据、分析结果。5肿瘤体积计算公式=宽度2x长度x0.52。结果：1药物处理对卵巢癌细胞Hey成瘤能力的影响药物组合Trichostatin A/Cisplatin组动物肿瘤体积较对照组减少约4倍。TSA0.3um组也有明显的肿瘤抑制效果且Decitabine 10um组和Cisplatin 1um组明显,Decitabine/Cisplatin抗肿瘤效果介于Decitabine 10um组和Cisplatin 1um组之间。从体积角度来看肿瘤的抑制能力顺序分别为：Trichostatin A/Cisplatin>Trichostatin A>Decitabine/ Cisplatin>Decitabine>control,从肿瘤重量角度来看肿瘤抑制能力顺序分别为：Trichostatin A/Cisplatin>Trichostatin A>Decitabine/Cisplatin>Decitabine>Cisplatin>control。肿瘤生长曲线提示Trichostatin A/Cisplatin联合用药较其他用药方案更能抑制肿瘤生长,并使肿瘤生长维持在较低的水平。2药物处理对卵巢癌细胞Hey种植及转移能力的影响根据对照组动物模型转移特点我们选取了十个部位作为参考,包括肝脏、脾、腹膜、肠系膜、大网膜、胃、盆腔壁、横隔、膀胱以及卵巢。实验结果显示TSA 0.3umm组和Cisplatin 1um组无肿瘤转移灶形成。而与此相对,Decitabine10um组,Trichostatin A/Cisplatin组及TSA/Decitabine组存在不同程度的转移灶形成。Decitabine 10um组主要转移部位有肝脏、脾、腹膜、肠系膜、横隔、膀胱以及卵巢。Trichostatin A/Cisplatin主要转移部位有肝脏、脾、大网膜以及膀胱,decitabine/Cisplatin主要转移部位有肝脏、脾、大网膜及卵巢。我们还观察了药物对种植后细胞转移能力的影响,结果显示所有组别的肿瘤均出现了转移。3药物处理对卵巢癌细胞Hey肿瘤生长能力的影响P53表达情况进行检测,结果显示CisplatinlowTrichostatin Ahigh、CisplatinloWDecitabinehigh、Trichostatin AlowCisplatinlow、DecitabinelowCisplatinlow可以导致P53升高。将卵巢癌细胞株种植到老鼠皮下待肿瘤形成后进行腹腔内药物治疗以观察药物对肿瘤生长能力的影响,结果发现肿瘤抑制能力的顺序分别：CisplatinlowDecitabinehigh>DecitabinelowCisplatinlow>CisplatinlowTrichostatin Ahigh>Control>Trichostatin AlowCisplatinlow>Trichostatin AhighDecitabinehigh。其中CisplatinlowDecitabinehigh抗肿瘤生长能力最强。结论：药物组合Trichostatin A/Cisplatin较单独用药更能抑制肿瘤生长和降低肿瘤负荷,并使肿瘤生长维持在较低的水平。Trichostatin A及Cisplatin处理过的细胞不能够在腹腔内形成肿瘤种植,其他药物组和联合用药具有肿瘤种植的器官特异性,序贯疗法Cisplatinlowdecitabinehigh抗肿瘤生长能力最强,DecitabinelowCisplatinlow治疗策略也具有较好的抗肿瘤效果。