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研究目的：
以胎盘屏障和胎儿血脑屏障的发育为切入点，观察ZrO2NPs穿过胎盘屏障和胎儿血脑屏障的胚胎毒性;探讨小鼠孕期胎盘屏障和胎儿血脑屏障不同发育阶段ZrO2NPs穿过生物屏障中的转运能力的大小;胎盘屏障和胎儿血脑屏障发育成熟后进一步探究纳米材料穿过生物屏障的转运机制。
研究方法：
1.研究设计
根据文献研究报道，母鼠胎盘屏障在孕期12.5天(Gestational day12.5记为GD12.5)左右成熟，胎鼠血脑屏障的发育在孕期15.5天(GD15.5)左右成熟。本研究设计的动物模型部分根据研究目的不同分为二部分:第一部分设计三个不同的屏障发育模型;Model1:胎盘屏障和胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的GD9-11暴露模型;Model2:胎盘屏障发育成熟，胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的GD13-15暴露模型:Model3:胎盘屏障和胎鼠血脑屏障已发育成熟的GD16-18暴露模型。利用以上三个暴露模型完成以下研究目的:探究ZrO2NPs穿过胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的一般毒性，探讨屏障发育不同阶段对纳米材料转运的影响。第二部分是探讨纳米材料经屏障转运机制:为排除生物屏障发育的干扰，采用胎盘屏障和胎鼠血脑屏障都发育成熟的模型，即GD16-18暴露模型。
另外，利用体外实验和人工胃液方法对ZrO2NPs进行纳米材料表征等定性研究。
2.动物模型中染毒设计与动物分组
根据饮用水中游离的ZrO2NPs含量将ZrO2NPs暴露组设计为三个剂量水平，即2.5、25和50mg/kg。ZrO2NPs纳米材料溶于水溶液制成三种不同浓度的混合液（0.25、2.5和5mg/ml）。低温超声30-60分钟后灌胃给药，给药容积为10ml/kg。染毒时间与样本收集的时间分别为Model1为GD9-11染毒，GD12天终止实验收集样本，Model2为GD13-15染毒GD16天终止实验收集样本，Model3为GD16-18染毒GD19天终止实验收集样本。
第一部分动物模型中，ICR小鼠合笼受孕后随机分为4组（每个暴露模型各分4组，共12组），每组12只孕鼠。第二部分动物模型中，ICR小鼠合笼受孕后随机分为4个剂量组，每组12只孕鼠。
3.研究内容与技术手段
3.1ZrO2NPs的表征
3.2ZrO2NPs的稳定性和一般毒性研究
3.3胎盘和胎鼠血脑屏障不同发育阶段影响ZrO2NPs经屏障转运
3.4ZrO2NPs穿过成熟胎盘和血脑屏障的转运机制
4.统计学分析
用Excel进行数据的录入，应用SPSS26.0进行统计学分析，以P＜0.05设为有统计学意义。实验数据符合正态分布，数据结果以均数±标准差表示。各模型各剂量组比较之前进行方差齐性检验。若各组之间方差齐，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni test;若各组之间方差不齐，则选用Welch检验，两两比较采用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis H test。
研究结果：
1.ZrO2NPs表征研究结果
TEM结果显示ZrO2NPs的粒径为15.8±3.9nm，提示饮用水中ZrO2NPs的尺寸主要集中在16nm左右。DLS结果显示ZrO2NPs的水合粒径为54.2±18.4nm（水溶液）和105.2±27.3nm（人工胃液），提示ZrO2NPs进入胃液后会有一定的聚集作用，在体内的聚集尺寸集中在105nm。ZrO2NPs的Zeta电位为25.0±6.1nm（水溶液）和-10.2±3.1nm（人工胃液），提示ZrO2NPs的稳定性较好，在体内产生大量聚集的可能性小。
2.ZrO2NPs稳定性和毒性研究结果
①三个模型随机分组后各组体重差异无统计学意义，提示各组间均衡可比;染毒期间各组孕鼠体重增长变化差异无统计学意义，各模型不同剂量组间孕鼠体重比较，差异无统计学意义，实验期间各组动物饮食和皮毛状况良好，染毒期间各组动物活动良好，均无死亡现象发生，提示染毒对动物引起的毒性较小;②孕期不同暴露模型(Model1，2，3)不同暴露剂量（2.5，25和50mg/kg的ZrO2NPs）对母鼠胎盘重量和胚胎丢失数目与对照组相比，差异无统计学意义;③各剂量组每窝胎鼠重量、每窝胎子数目以及每窝胎鼠的体长和尾长与对照组相比，差异无统计学意义。提示ZrO2NPs在当前暴露剂量下，未观察到ZrO2NPs暴露所导致的母体生殖毒性和子代发育毒性。
④胎盘的HE染色和TUNEL凋亡结果显示:胎盘HE染色结果显示胎盘组织结构与对照组比较没有明显改变;TUNEL凋亡水平各组间差异没有统计学意义。⑤胎脑的免疫荧光结果显示:相比于对照组，三种模型不同剂量组间胎脑的神经元数目无明显差异:各剂量组未观察到激活的小胶质细胞和星形胶质细胞。⑥氧化应激研究结果显示，三种模型下不同剂量组间胎盘组织和子代胎脑组织中GSH、GSSG、GSH/GSSG水平比较，差异无统计学意义，提示ZrO2NPs未引起胎盘组织和子代胎脑组织明显的氧化应激反应;⑦炎性因子表达水平研究结果显示，三种模型下不同剂量组间胎盘组织和子代胎脑组织中TNF-α、IL-1β相关指标比较，差异无统计学意义。以上结果显示，在当前剂量下ZrO2NPs经胎盘转运和胎儿血脑屏障的稳定性较好，可用于研究纳米材料与屏障转运的作用。
3.屏障不同发育阶段对ZrO2NPs经胎盘和血脑屏障转运的影响
3.1ZrO2NPs在胎鼠体内分布:在不同暴露模型中，ICP-MS检测到Zr元素的含量在胎脑和胎肝中含量与对照组相比，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。在胎盘屏障和胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的Model1中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了3.4倍和5.0倍，在胎肝中分别增加了6.1倍和9.8倍;在胎盘屏障发育成熟但胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的Model2中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了2.3倍和3.5倍，在胎肝中分别增加了3.7倍和5.6倍;在胎盘屏障和胎鼠血脑屏障均已发育成熟的Model3中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了1.8倍和2.6倍，在胎肝中分别增加了2.5倍和3.5倍。同时，TEM观察到胎肝和胎脑内的含有ZrO2NPs颗粒，并且EDX元素分析进一步证实电镜下的物质为ZrO2NPs颗粒。另外，三个剂量组的ZrO2NPs在胎盘中含量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P值均＜0.05）。说明ZrO2NPs可以穿过胎盘屏障和胎鼠血脑屏障进入胎儿体内。
3.2生物屏障发育状况影响纳米转运能力比较:随着胎盘屏障和胎鼠血脑屏障发育，ZrO2NPs穿过屏障进入胎儿体内的量逐渐减少。与胎盘屏障成熟后相比(Model2)，ZrO2NPs穿过未成熟胎盘屏障的量增加64％(Model1)。与胎鼠血脑屏障成熟后相比(Model3)，ZrO2NPs穿过未成熟血脑屏障的量增加55％(Model2)。与两种屏障都成熟相比(Model3)，ZrO2NPs穿过两种未成熟屏障进入胎脑的含量增加96％(Model1)。上述结果提示生物屏障的发育对纳米材料穿过屏障起重要作用。通过对胎盘屏障和血脑屏障的形态学动态观察发现，屏障发育未成熟时，细胞间紧密连接空隙较大。
3.3屏障不同发育阶段中胎盘与胎脑组织紧密连接蛋白表达水平:Western blot结果也显示，胎盘与胎脑组织中紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1随两种屏障的发育呈时间依赖型增加(P＜0.05)。提示紧密连接在屏障成熟前后的不同可能是影响ZrO2NPs穿过屏障差异的主要原因。
4.ZrO2NPs穿过成熟屏障的转运机制
4.1跨细胞转运机制:Qrt-PCR和Western blot结果显示ZrO2NPs穿过胎盘和胎鼠血脑屏障后引起Caveolae，Clathrin和Arf6等受体介导的内吞途径相关蛋白呈剂量依赖型增加（P值均＜0.05）。
4.2细胞旁路转运机制:免疫荧光结果显示，与对照组相比，ZrO2NPs破坏胎盘屏障和血脑屏障细胞间的紧密连接，致使细胞间孔道增大。Westem blot结果显示ZrO2NPs暴露后胎盘和血脑屏障的Claudin-5，Occludin和ZO-1等紧密连接蛋白呈剂量依赖型下降（P值均＜0.05）。
研究结论：
1.ZrO2NPs进入不同孕期孕鼠体内具有良好的稳定性和生物相容性，可用于研究单纯屏障发育与纳米材料转运量之间的关系。
2.ZrO2NPs可穿过不同发育时期的胎盘屏障和胎鼠血脑屏障进入胎脑内，提示其在纳米载药方面良好应用前景。
3.胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的发育状况影响ZrO2NPs进入胎儿体内的转运量:ZrO2NPs更容易穿过未成熟的胎盘屏障和胎鼠血脑屏障。
4.孕期不同阶段，屏障内紧密连接的发育是影响ZrO2NPs的转运量的主要机制。
5.ZrO2NPs穿过成熟胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的转运机制包括受体介导的内吞途径以及破坏细胞间的紧密连接跨细胞转运机制。
以胎盘屏障和胎儿血脑屏障的发育为切入点，观察ZrO2NPs穿过胎盘屏障和胎儿血脑屏障的胚胎毒性;探讨小鼠孕期胎盘屏障和胎儿血脑屏障不同发育阶段ZrO2NPs穿过生物屏障中的转运能力的大小;胎盘屏障和胎儿血脑屏障发育成熟后进一步探究纳米材料穿过生物屏障的转运机制。
研究方法：
1.研究设计
根据文献研究报道，母鼠胎盘屏障在孕期12.5天(Gestational day12.5记为GD12.5)左右成熟，胎鼠血脑屏障的发育在孕期15.5天(GD15.5)左右成熟。本研究设计的动物模型部分根据研究目的不同分为二部分:第一部分设计三个不同的屏障发育模型;Model1:胎盘屏障和胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的GD9-11暴露模型;Model2:胎盘屏障发育成熟，胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的GD13-15暴露模型:Model3:胎盘屏障和胎鼠血脑屏障已发育成熟的GD16-18暴露模型。利用以上三个暴露模型完成以下研究目的:探究ZrO2NPs穿过胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的一般毒性，探讨屏障发育不同阶段对纳米材料转运的影响。第二部分是探讨纳米材料经屏障转运机制:为排除生物屏障发育的干扰，采用胎盘屏障和胎鼠血脑屏障都发育成熟的模型，即GD16-18暴露模型。
另外，利用体外实验和人工胃液方法对ZrO2NPs进行纳米材料表征等定性研究。
2.动物模型中染毒设计与动物分组
根据饮用水中游离的ZrO2NPs含量将ZrO2NPs暴露组设计为三个剂量水平，即2.5、25和50mg/kg。ZrO2NPs纳米材料溶于水溶液制成三种不同浓度的混合液（0.25、2.5和5mg/ml）。低温超声30-60分钟后灌胃给药，给药容积为10ml/kg。染毒时间与样本收集的时间分别为Model1为GD9-11染毒，GD12天终止实验收集样本，Model2为GD13-15染毒GD16天终止实验收集样本，Model3为GD16-18染毒GD19天终止实验收集样本。
第一部分动物模型中，ICR小鼠合笼受孕后随机分为4组（每个暴露模型各分4组，共12组），每组12只孕鼠。第二部分动物模型中，ICR小鼠合笼受孕后随机分为4个剂量组，每组12只孕鼠。
3.研究内容与技术手段
3.1ZrO2NPs的表征
3.2ZrO2NPs的稳定性和一般毒性研究
3.3胎盘和胎鼠血脑屏障不同发育阶段影响ZrO2NPs经屏障转运
3.4ZrO2NPs穿过成熟胎盘和血脑屏障的转运机制
4.统计学分析
用Excel进行数据的录入，应用SPSS26.0进行统计学分析，以P＜0.05设为有统计学意义。实验数据符合正态分布，数据结果以均数±标准差表示。各模型各剂量组比较之前进行方差齐性检验。若各组之间方差齐，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni test;若各组之间方差不齐，则选用Welch检验，两两比较采用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis H test。
研究结果：
1.ZrO2NPs表征研究结果
TEM结果显示ZrO2NPs的粒径为15.8±3.9nm，提示饮用水中ZrO2NPs的尺寸主要集中在16nm左右。DLS结果显示ZrO2NPs的水合粒径为54.2±18.4nm（水溶液）和105.2±27.3nm（人工胃液），提示ZrO2NPs进入胃液后会有一定的聚集作用，在体内的聚集尺寸集中在105nm。ZrO2NPs的Zeta电位为25.0±6.1nm（水溶液）和-10.2±3.1nm（人工胃液），提示ZrO2NPs的稳定性较好，在体内产生大量聚集的可能性小。
2.ZrO2NPs稳定性和毒性研究结果
①三个模型随机分组后各组体重差异无统计学意义，提示各组间均衡可比;染毒期间各组孕鼠体重增长变化差异无统计学意义，各模型不同剂量组间孕鼠体重比较，差异无统计学意义，实验期间各组动物饮食和皮毛状况良好，染毒期间各组动物活动良好，均无死亡现象发生，提示染毒对动物引起的毒性较小;②孕期不同暴露模型(Model1，2，3)不同暴露剂量（2.5，25和50mg/kg的ZrO2NPs）对母鼠胎盘重量和胚胎丢失数目与对照组相比，差异无统计学意义;③各剂量组每窝胎鼠重量、每窝胎子数目以及每窝胎鼠的体长和尾长与对照组相比，差异无统计学意义。提示ZrO2NPs在当前暴露剂量下，未观察到ZrO2NPs暴露所导致的母体生殖毒性和子代发育毒性。
④胎盘的HE染色和TUNEL凋亡结果显示:胎盘HE染色结果显示胎盘组织结构与对照组比较没有明显改变;TUNEL凋亡水平各组间差异没有统计学意义。⑤胎脑的免疫荧光结果显示:相比于对照组，三种模型不同剂量组间胎脑的神经元数目无明显差异:各剂量组未观察到激活的小胶质细胞和星形胶质细胞。⑥氧化应激研究结果显示，三种模型下不同剂量组间胎盘组织和子代胎脑组织中GSH、GSSG、GSH/GSSG水平比较，差异无统计学意义，提示ZrO2NPs未引起胎盘组织和子代胎脑组织明显的氧化应激反应;⑦炎性因子表达水平研究结果显示，三种模型下不同剂量组间胎盘组织和子代胎脑组织中TNF-α、IL-1β相关指标比较，差异无统计学意义。以上结果显示，在当前剂量下ZrO2NPs经胎盘转运和胎儿血脑屏障的稳定性较好，可用于研究纳米材料与屏障转运的作用。
3.屏障不同发育阶段对ZrO2NPs经胎盘和血脑屏障转运的影响
3.1ZrO2NPs在胎鼠体内分布:在不同暴露模型中，ICP-MS检测到Zr元素的含量在胎脑和胎肝中含量与对照组相比，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。在胎盘屏障和胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的Model1中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了3.4倍和5.0倍，在胎肝中分别增加了6.1倍和9.8倍;在胎盘屏障发育成熟但胎鼠血脑屏障尚未发育成熟的Model2中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了2.3倍和3.5倍，在胎肝中分别增加了3.7倍和5.6倍;在胎盘屏障和胎鼠血脑屏障均已发育成熟的Model3中，25mg/kg和50mg/kg剂量组的Zr元素在胎脑中的含量分别增加了1.8倍和2.6倍，在胎肝中分别增加了2.5倍和3.5倍。同时，TEM观察到胎肝和胎脑内的含有ZrO2NPs颗粒，并且EDX元素分析进一步证实电镜下的物质为ZrO2NPs颗粒。另外，三个剂量组的ZrO2NPs在胎盘中含量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P值均＜0.05）。说明ZrO2NPs可以穿过胎盘屏障和胎鼠血脑屏障进入胎儿体内。
3.2生物屏障发育状况影响纳米转运能力比较:随着胎盘屏障和胎鼠血脑屏障发育，ZrO2NPs穿过屏障进入胎儿体内的量逐渐减少。与胎盘屏障成熟后相比(Model2)，ZrO2NPs穿过未成熟胎盘屏障的量增加64％(Model1)。与胎鼠血脑屏障成熟后相比(Model3)，ZrO2NPs穿过未成熟血脑屏障的量增加55％(Model2)。与两种屏障都成熟相比(Model3)，ZrO2NPs穿过两种未成熟屏障进入胎脑的含量增加96％(Model1)。上述结果提示生物屏障的发育对纳米材料穿过屏障起重要作用。通过对胎盘屏障和血脑屏障的形态学动态观察发现，屏障发育未成熟时，细胞间紧密连接空隙较大。
3.3屏障不同发育阶段中胎盘与胎脑组织紧密连接蛋白表达水平:Western blot结果也显示，胎盘与胎脑组织中紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1随两种屏障的发育呈时间依赖型增加(P＜0.05)。提示紧密连接在屏障成熟前后的不同可能是影响ZrO2NPs穿过屏障差异的主要原因。
4.ZrO2NPs穿过成熟屏障的转运机制
4.1跨细胞转运机制:Qrt-PCR和Western blot结果显示ZrO2NPs穿过胎盘和胎鼠血脑屏障后引起Caveolae，Clathrin和Arf6等受体介导的内吞途径相关蛋白呈剂量依赖型增加（P值均＜0.05）。
4.2细胞旁路转运机制:免疫荧光结果显示，与对照组相比，ZrO2NPs破坏胎盘屏障和血脑屏障细胞间的紧密连接，致使细胞间孔道增大。Westem blot结果显示ZrO2NPs暴露后胎盘和血脑屏障的Claudin-5，Occludin和ZO-1等紧密连接蛋白呈剂量依赖型下降（P值均＜0.05）。
研究结论：
1.ZrO2NPs进入不同孕期孕鼠体内具有良好的稳定性和生物相容性，可用于研究单纯屏障发育与纳米材料转运量之间的关系。
2.ZrO2NPs可穿过不同发育时期的胎盘屏障和胎鼠血脑屏障进入胎脑内，提示其在纳米载药方面良好应用前景。
3.胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的发育状况影响ZrO2NPs进入胎儿体内的转运量:ZrO2NPs更容易穿过未成熟的胎盘屏障和胎鼠血脑屏障。
4.孕期不同阶段，屏障内紧密连接的发育是影响ZrO2NPs的转运量的主要机制。
5.ZrO2NPs穿过成熟胎盘屏障和胎鼠血脑屏障的转运机制包括受体介导的内吞途径以及破坏细胞间的紧密连接跨细胞转运机制。