ISSR标记对广西产鸡血藤遗传多样性及其混伪品鉴别的研究

来源 :广西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaxianfeiaini
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目的:本文开展对广西产鸡血藤及其混伪品的ISSR指纹图谱与遗传多样性研究,为鸡血藤的品质鉴定与评价提供分子水平的理论依据,以期为临床的安全有效使用提供保障,也为广西产鸡血藤的质量评价体系的完善提供帮助。  方法:在广西区内共采集9份正品鸡血藤,其中5份栽培品,4份野生品。同时采集了5种鸡血藤常见混伪品,分别为豆科植物网络崖豆藤(Millettia reticulate Benth.)、香花崖豆藤(Millettia dielsiana Harms.)、白花油麻藤(Mucuna birdwoodiana Tutcher.)、大果油麻藤(Mucuna macrocarpa Wall.)、常春油麻藤(Mucuna sempervirens Hemsl.),并对正品与这5种混伪品从形状、颜色、大小(直径)、表面特征、树脂状分泌物以及偏心性环纹数这几个方面进行了分析比较。在DNA分子标记方面,利用9种DNA提取方法对鸡血藤DNA进行了提取,鸡血藤常见混伪品中白花油麻藤、常春油麻藤、大果油麻藤均为油麻藤属植物,常用的CTAB(C16H33(CH3)3NBr十六烷基三甲基溴化铵)提取法未能提取出油麻藤属植物的DNA,且有文献曾报道在提取鸡血藤的混淆品种白花油麻藤时,由于不同植物存在不同次级代谢,该法得到的DNA无法进行PCR(polymerase chain reaction聚合酶链式反应)扩增。因此,我们提取油麻藤属植物DNA时,在植物基因组DNA提取试剂盒法基础上进行进一步的优化,对提取出的DNA进行电泳检测得DNA指纹图谱,并对结果进行分析。随之,采用ISSR方法进行广西产鸡血藤与其混伪品的真伪鉴别。并采用RAPD(随机扩增多态DNA random amplified polymorph ism DNA)方法与ISSR方法对广西产不同居群的鸡血藤进行遗传多样性分析。  结果:1、性状比较方面:正品与混伪品从性状特征来看,主要是树脂状分泌物色泽的差异以及偏心性环纹数的不同。正品鸡血藤的偏心性环纹较多,而混伪品仅有1-2个,其他方面无特别明显的区别。2、DNA提取方面:比较9种方法提取出的鸡血藤DNA的质量,最终选定植物基因组DNA提取试剂盒法为鸡血藤DNA的提取方法,该法简便快捷,易于操作,且结果稳定,提取出的DNA可为后续PCR反应提供稳定模板。对于油麻藤属植物,最终选定植物基因组DNA提取试剂盒改良纯化法来去除油麻藤属植物中干扰DNA质量的多酚类物质等次生代谢产物,提出的DNA质量好,纯度高,为油麻藤属植物DNA的最佳提取方法。3、ISSR法鉴别广西产鸡血藤与其混伪品方面:从13条ISSR引物中筛选出5条多态性好,重复性高,稳定性强能够明显区别正品与伪品的引物,扩增出的DNA指纹图谱具有明显差异。4、RAPD与ISSR分析广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性方面:筛选出的3条RAPD引物及4条ISSR引物扩增后,共得到198和315个位点,多态性位点37、80个,多态性位点比率18.7%、25.4%,有效等位基因数为1.4168、1.5840,基因多样性指数为0.2694、0.3513,Shannon多样性指数为0.4316、0.5299,ISSR标记均高于RAPD标记,显然,ISSR标记检测多样性的能力更高。ISSR和RAPD的平均遗传相似系数为0.75764、0.68380,ISSR标记小于RAPD标记,表明ISSR检测遗传多样性更灵敏。通过Ntsys软件构建的RAPD和ISSR的聚类图看出,二者的聚类结果相近。且SPSS17.0软件的双变量相关分析(Bivariate)法对两种标记的遗传相似系数矩阵进行相关分析得出,两者的相关系数r=0.847,为极显著水平,表明结果的相似性。  结论:ISSR标记方法可用来作为鉴别鸡血藤与其混伪品的手段,为鸡血藤与其混伪品在分子水平上的鉴定提供依据。比RAPD标记反映出更多的遗传多样性信息,更适合于广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性研究。
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