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14-3-3蛋白作为一种天然的二聚体蛋白,在植物细胞中识别并结合靶蛋白白分子,调控植物细胞内的各种生命活动,主要协助营养物质交换和运输、调节植物体生长和发育、促进植物体细胞的新陈代谢、应对植物体外界胁迫、控制植物细胞内信号传递路径等。在植物细胞中,14-3-3蛋白由多个不同的基因编码,不同的14-3-3基因有其功能上的特异性。因此,我们在分析植物体内的不同14-3-3基因功能时,既要检测14-3-3基因的表达水平,也要分析14-3-3基因所表达蛋白的含量。目前通常多采用RT-PCR来检测基因转录水平,同时采用WB检测蛋白表达水平。但是这些检测方法均有着各自的不足,在使用过程中,RT-PCR操作时间较长,且仪器成本运行更高;WB检测方法也存在操作过程较为繁琐,同时还存在检测限不足。相比之下,电化学传感器检测方法具有检测灵敏性更高、操作过程耗时较短、可重复储存使用、检测成本较低等优点。本研究通过构建电化学DNA传感器和蛋白免疫传感器,对本实验室已培植的转基因烟草中的14-3-3g基因转录水平和表达蛋白的含量水平进行检测分析,来验证金标14-3-3蛋白抗体制备的免疫传感器和电化学DNA传感器的可行性与实际应用价值,获得主要研究结果如下:1、基于DNA碱基配对互补性的原理构建DNA传感器,对14-3-3g基因核酸DNA的含量水平进行检测。以丝网印刷碳电极为DNA传感器的工作电极,基于胶体金和壳聚糖的静电吸附将DNA单链分子固定在工作电极上,并作为DNA传感器的DNA探针序列,与单链分子的DNA目标序列根据DNA双链分子的碱基间特异性互补配对并结合的原理,最后被组装并固载于传感器工作电极上。互补的双链DNA通过吸附指示剂亚甲基蓝,组装成完整的DNA传感器。将构建好的DNA传感器连接电化学分析工作台站,在工作电极上滴加盐酸缓冲液Tris-HCl,作为电化学反应液,亚甲基蓝再催化氧化盐酸缓冲液Tris-HCl,形成电化学催化信号电流而被电化学分析工作站检测出来。基于不同浓度的DNA目标序列而形成不同电化学信号电流值的大小,目标DNA序列在0.1-1.15μmol/L范围内时,DPV伏安曲线的电流峰值与目标DNA序列浓度呈良好的线性关系,线性回归方程为y=-13.333x+22.29,R~2=0.9951。通过提取14-3-3转基因烟草叶的总RNA,结合DNA传感器工作电极上的DNA单链探针序列,进行碱基互补配对杂交反应,实现对14-3-3g基因转录水平的检测。结果表明与野生对照烟草WT相比,RNAi干扰表达植株i2和i1中的14-3-3g基因的转录水平分别下降63.2%和68.4%;而过量表达植株p2和pl中的14-3-3g基因的转录水平分别上升47.1%和37.3%。这个结果与RT-PCR分析结果相一致,使用该方法进行检测时,无需将所提的RNA反转成cDNA,相比RT-PCR节约了时间和资源。2、制备了基于酶-抗体共偶联金(AuNs)纳米探针进行信号放大的14-3-3蛋白检测免疫传感器。利用金纳米粒子偶联负载过氧化氢催化酶(CAT)和14-3-3抗体(anti-14-3-3),制得纳米信号探针(CAT-Au-anti-14-3-3 signal probe,简称CASP)。将14-3-3抗体(anti-14-3-3)、14-3-3蛋白(14-3-3)和纳米信号探针(CASP)层层组装到多壁碳纳米管(MWCNTs)和纳米金(Au)修饰的丝网印刷电极(SPCE)表面,制得SPCE│MWCNTs/Au-anti-14-3-3/14-3-3/CASP免疫型传感器,可对H2O2产生还原催化电流。在室温20℃条件下,传感器对14-3-3蛋白检测浓度范围为0.02-5ng/μL时,稳态信号电流值与14-3-3蛋白浓度呈现良好的线性关系:y=356.16x+192.57,相关系数R~2=0.9987达到极显著水准;测定的标准偏差均小于0.5%,具有较好的重复性。另外,该传感器对转基因烟草植物14-3-3蛋白检测与传统的Western Blot检测结果较一致。同时,该方法检测限范围比传统的蛋白印迹分析的检测限范围更宽,灵敏度更高。因此,该电化学方法检测具有灵敏度高,免疫性强,选择性和重复性好等优点,可用于对14-3-3蛋白的定量检测。