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温度是影响刺参生长和生理活动的重要因子,为研究刺参应答高温胁迫的分子机制,采用抑制性消减杂交技术成功构建了刺参高温胁迫正反消减cDNA文库。利用实时荧光定量PCR技术,通过相对定量2-△△CT法对部分差异表达基因的表达特点进行了分析。一、刺参高温胁迫消减cDNA文库的构建与分析利用抑制性消减杂交技术,分别以高温处理组为检测组(tester)常温对照组为驱动组(driver),进行正向消减杂交,构建正向cDNA消减文库；以常温组为tester、高温组为driver,进行反向消减杂交,构建反向cDNA消减文库。从两个文库随机挑选384个白斑克隆进行斑点杂交进一步筛选,对其中信号差异显著的50个克隆进行测序分析。测序结果经BLAST比对分析得出：44个克隆与已知基因序列高度同源,其中重要功能基因包括上调的热休克蛋白70 (Heat Shock Protein 70, HSP70)、线粒体核糖体大亚基RNA(mitochondrial large subunit ribosomal RNA, mt LSU rRNA)、致死必需蛋白[Protein lethal (2) essential for life, Protein 1(2)efl]等基因和下调表达的刺参主要卵黄蛋白1(major yolk protein 1, MYP1)和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9), PCSK9为新发现的刺参基因,GenBank提交序列号为ADI40137.1；另外5个克隆为未知新基因序列。二、5个差异表达基因在刺参不同组织、不同温度以及不同胁迫时间下的表达采用实时荧光定量PCR技术,通过相对定量2-△△CT法,以刺参看家基因β-actin为内参进行校正,比较了5个差异表达基因在刺参的体壁、纵肌、消化道、呼吸树等组织中的表达情况。对比常温下的刺参各组织间,结果显示5个基因在4个组织中均有表达,其中HSP70、mt LSU rRNA、Protein 1(2)efl和PCSK9在体壁中表达量最高,MYP1在消化道中表达量最高；经过高温胁迫后,同一基因在刺参各组织中表达量的变化也存在差异,其中HSP70、Protein 1(2)efl、MYP1的表达量在呼吸树中的变化最显著,Int LSU rRNA在体壁中的变化最显著,PCSK9在纵肌中的变化最显著。采用相同的技术方法分析了5个差异表达基因在不同胁迫温度下的表达特点。通过设定18、21、24、27、30℃等5个恒定温度,胁迫相同时间后,检测5个基因在不同温度下的的表达水平,以18℃下各基因的表达量为基准1：在18-30℃范围内,HSP70、mt LSU rRNA、Protein 1(2)efl的表达量随着温度的升高而上升,其中以HSP70最为显著,30℃时的表达量为3.32,mt LSU rRNA和Protein 1(2)efl在30℃时的表达量分别为2.89和2.58；而MYP1、PCSK9表现为随着温度升高其表达量下降,MYP1在30℃表达量最低为0.66,PCSK9在30℃较27℃的表达量0.54略微上升,但总体还是呈现下调表达。最后分析了5个差异表达基因在高温胁迫过程中的表达特点。检测各基因在30℃胁迫过程中的0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h等7个时间点的表达水平,以0h时的表达量为基准1：HSP70的表达表现为先升后降再升,在3h达到最大值为4.59；mt LSU rRNA的表达量呈现平稳上升,在3h达到最大值为2.27；Protein 1(2)efl表达量为先升后降,在2.5 h达到最大值2.1,总体表现为上调表达；MYP1表达量持续下降并在3h达到最小值0.56；PCSK9表达量先降后升,在2h达到最小值0.5,但总体表现为下调表达。