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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌,能形成伴胞晶体和芽胞。在芽胞成熟后,母细胞裂解,此时绝大多数Bt的晶体与芽胞分离,而少数Bt(如幕虫亚种)的晶体在芽胞外壁内侧形成而与芽胞不分离,我们称之为晶胞粘连(Spore-Crystal Association,简称SCA),其晶体称为粘连晶体。国内外对SCA的研究进展目前主要集中在本课题组对Bt暮虫亚种YBT-020的研究上,已确定了粘连晶体定位在芽胞外壁“帽子结构”内侧,其决定因子是大质粒pBMB28上的两个基因scaA和scaB,维持SCA稳定的因子是scaC、scaD和scaE基因。还证明了粘连晶体的主要成分是晶体蛋白Cry26Aa(其基因位于大质粒pBMB26上)。另外发现在仅有芽胞外壁“帽子结构”存在时就可导致晶体粘连,但需要完整的芽胞外壁才能维持粘连表型的稳定。但ScaA和ScaB如何将以Cry26Aa蛋白为主的粘连晶体定位到芽胞外壁和芽胞衣之间仍然未知,推测ScaA、ScaB蛋白通过与Cry26Aa蛋白直接或间接的相互作用决定晶体的定位。但本课题组前期通过酵母双杂交和斑点杂交等技术均没有检测到ScaA、ScaB蛋白与Cry26Aa蛋白间的直接相互作用,本研究在此基础上展开,主要成果如下。1、通过细菌双杂交、Ligand Blot和GST Pull Down技术证明了Cry26Aa和ScaA、ScaB蛋白间的直接相互作用,为解决ScaA、ScaB蛋白决定粘连晶体定位的机制提供一个直接有效的证据。2、通过细菌双杂交技术筛选和构建了YBT-020中与SCA相关的芽胞外壁、芽胞衣蛋白间的相互作用网络。将从YBT-020中预测到的芽胞外壁和芽胞衣蛋白基因以及scaA、scaB、scaC、scaD和scaE等共87个基因构建成细菌双杂交靶标筛选文库,从中筛选到与Cry26Aa、ScaA和ScaB蛋白有相互作用的蛋白分别为26、23和5个,并以这些蛋白为诱饵继续从文库中筛选,得到1236对相互作用,将所有得到的相互作用通过Cytoscape软件绘制成蛋白相互作用网络。3、在构建的蛋白相互作用网络基础上结合蛋白的功能,我们推测BclA、BclB、ExsFB、BxpB、CotY、ExsY、ExsB、CotE、YaaH、InH2和Yckk2等蛋白可能是影响SCA表型的关键蛋白,并通过基因敲除验证了BclA2-2、Yckk2、Bcl B和YaaH蛋白是影响SCA的关键蛋白。4、结合SCA相关的蛋白互作网络、已确定的影响SCA的关键蛋白以及Cry26Aa与ScaA、ScaB蛋白间的直接相互作用,推测出粘连晶体的定位模型。首先CotY蛋白组装帽子结构基本骨架,接着BclA、BxpB、ExsFB等蛋白的组装形成完整的帽子结构,期间ScaA、Cry26Aa通过与BclA等蛋白间的相互作用聚集到帽子结构,在ScaA、ScaB蛋白及帽子结构共同作用下使Cry26Aa逐步形成晶核,并最终形成粘连晶体。这为全面揭示SCA形成的动态过程提供了重要信息;同时,此蛋白互作网络展现了芽胞外壁、芽胞衣和晶体间在分子水平的联系,为揭示芽胞外壁、芽胞衣的形成机制和芽胞与晶体共发育模式机制的研究打下基础。此外,提出发掘不同具有SCA的Bt菌株的不同粘连决定因子的新思路,即筛选同时与粘连晶体蛋白及与其有相互作用的芽胞外壁和芽胞衣蛋白有直接相互作用的蛋白,这些蛋白便是潜在的粘连决定因子,进一步通过对其基因敲除可以进行验证。这将会加快解决更多Bt不同SCA的形成机制,促进SCA形成的普遍机制的研究,进而为研制“生物囊”新型Bt杀虫剂打下理论基础。