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目的 糖皮质激素(glucocorticoid,GC)广泛用于各种自身免疫疾病和炎症疾病的治疗,然而糖皮质激素的过度使用可引起糖皮质激素性骨质疏松症(Glucoconicoid induced osteopomsis,GIOP),导致骨量丧失以及骨折风险的增加,其高发病率、患病部位多位于中轴骨,具有较高的致残率、致死率。目前治疗GIOP的药物常引起各种不良副作用。因此,本实验通过建立斑马鱼幼鱼骨质疏松模型,采用全转录组测序分析挖掘参与GIOP发病的基因调控网络并加以验证,为进一步明确GIOP的发病机制及靶向治疗提供新思路。方法1.将斑马鱼随机分6组,采用茜素红染色观察25μM泼尼松龙处理受精后8d、9d、10d斑马鱼骨骼矿化水平。2.将实验一受精10dpf的斑马鱼幼鱼处死,进行全转录组测序分析,提取总RNA后构建cDNA文库,制备转录组测序文库,计算分析两组样本的差异性基因表达。3.将所得转录组测序文库进行基因GO功能分析和KEGG信号通路富集分析。4.①通过PCR法检测斑马鱼GIOP模型组织itgα10 mRNA、itgβ11 mRNA的表达水平,以从技术水平验证测序结果的可靠性;②通过利用CRISPR/Cas9基因敲除技术,构建斑马鱼itgα10和itgβ11的基因突变体,通过比较干预后斑马鱼骨骼染色矿化面积,探讨itgα10和itgβ11对斑马鱼幼鱼骨代谢的调节作用;5.斑马鱼随机分4组(n=5)通过往斑马鱼注射外源性itgα10和(或)itgβ11修饰mRNA,观察比较GIOP斑马鱼的骨骼矿化水平。结果1.受精10 dpf在斑马鱼25μM泼尼松龙干预下其骨骼矿化水平降低(P<0.05),且随着作用时间的延长,斑马鱼幼鱼的骨矿化水平越低(P<0.05)。2.通过RNA-seq测序成功构建两组样本的转录组,聚类分析得出两组间斑马鱼基因存在差异性表达。3 通过对转录组进行基因GO和KEGG分析得出,在细胞外基质和胶原蛋白三聚体可能参与糖皮质激素诱导骨质疏松症的整个生物过程,而粘着信号通路是差异最显著的信号传导通路。4.GIOP斑马鱼组织中itgα10、itgβ11mRNA表达较野生对照组下调,基因敲除itgα10、itgβ11后,斑马鱼受精后10 d后骨矿化的染色面积较模型组明显降低(P<0.05)。5.单独外源性itgα10、itgβ11修饰RNA干预下,斑马鱼受精后10 d后骨矿化的染色面积较模型组明显提高(P<0.05),外源性itgα10和itgβ11均可减轻斑马鱼骨质疏松;此外,itgα10和itgβ11修饰的mRNA共同注射到斑马鱼单细胞受精卵后,斑马鱼受精后10d后骨矿化的染色面积较模型组明显提高(P<0.05),得出itgα10和itgβ11修饰RNA对骨质疏松斑马鱼的调节具有协同作用。结论1.25μM泼尼松龙可诱导斑马鱼幼鱼出现骨质疏松症样表型,且干预时间的延长,斑马鱼幼鱼的骨矿化水平越低。2.由基因功能分析,可推断泼尼松龙可能通过itgα10和itgβ11参与骨代谢相关信号同路的调节。3.GIOP的差异性基因表达与富集GO term和信号通路相关,其中以细胞外基质和胶原蛋白三聚体及粘着信号通路尤甚。4.itgα10和itgβ11基因可抑制泼尼松龙对斑马鱼骨矿化的下调作用。5.外源性itgα10和itgβ11修饰RNA均可减轻斑马鱼骨质疏松,且两者具有协同作用。