研究背景:结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率在全世界范围内逐年上升。目前在我国恶性肿瘤死亡的患者中位居第3，传统治疗方案对于患者的生存改善已经进入平台期。而过继免疫治疗已成为在手术、化疗、放疗之后的第四大治疗肿瘤的方法，其从加强和重建自身抗肿瘤免疫能力的角度出发，正在逐渐显示出独特的优势。人体抗击肿瘤是通过一个复杂的免疫网络来完成的，其中肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)是彻底清除肿瘤的核心因素，因此如何在体外或体内诱导并扩增出足够数量和具有强大杀伤功能的CTL，是实现免疫细胞过继治疗疗效的关键。树突状细胞(DC)已被证实为抗原递呈能力最强的细胞，在诱导肿瘤特异性免疫中起着十分重要的作用。由于肿瘤抗原性较弱，患者DC可能存在低能或失能，因此往往难以激发出自身强有力的肿瘤特异性免疫。如何在促进DC摄取、消化和递呈抗原方面优化条件，制备出优良的DC疫苗以打破肿瘤免疫耐受，是增强肿瘤特异性免疫能力的重要途径之一。目前制备DC疫苗时主要采用完整肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞酸洗脱肽、肿瘤抗原多肽等，作为冲击DC的肿瘤抗原，其中最常采用的是抗原表位最完全的肿瘤细胞裂解物。但有些患者失去手术机会或手术时未能留取自体肿瘤组织而无法利用该类抗原。对于上述各类肿瘤抗原，亦缺乏其致敏DC后疗效的平行比较。此外，DC细胞的成熟也是抗原递呈过程的重要因素。目前DC负载抗原后常用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为促成熟剂。但需要探索效率更高的促进DC成熟及活化的制剂。Tuftsin是一种由人体脾脏分泌的多肽类物质，通过与细胞表面的特定受体结合，促进吞噬细胞的吞噬作用来达到杀伤肿瘤的效果，但对于DC的作用尚不明确，有待进一步的实验进行研究。　　研究目的:本研究尝试应用不同人结肠癌抗原致敏DC，及联合不同促DC成熟剂制备DC疫苗，比较其对DC成熟状态及功能的影响。观察不同条件致敏DC细胞后诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞的效果，以及在体外及体内对人结肠癌细胞的抑制作用。探讨负载人结肠癌抗原多肽联合Tuftsin致敏DC后诱导CTL的过继细胞免疫疗法的可行性及有效性。　　研究方法:　　1）抽取健康人外周血，密度梯度离心分离制备PBMCs，贴壁法细胞培养DC，分别用抗原多肽、sw-480细胞裂解物碎片致敏DC，后用TNF-α及 Tuftsin诱导。将肿瘤抗原荷载的DC与未贴壁的PBMCs混合，加入到培养基中，14d后收获CTL。　　2）流式细胞仪检测不同条件致敏的DC和CTL细胞表型。　　3）ELISA法检测DC上清液中IL-12和IL-10含量，T细胞上清液中IFN-γ含量。　　4) LDH释放法检测分别用不同条件致敏的DC诱导CTL的体外细胞毒作用。　　5）人结肠癌细胞sw-480复苏及传代培养，取处于对数生长期的人结肠癌细胞调整细胞密度为2×106/ml注射于裸鼠皮下，观察肿瘤生长情况。　　6）接种肿瘤细胞后的裸鼠在置瘤后的第7、12、17天按照以下分组情况行尾静脉注射治疗:　　A组:生理盐水;　　B组:sw-480细胞裂解物碎片致敏、TNF-α刺激的DC所诱导的CTL;　　C组:sw-480细胞裂解物碎片致敏、Tuftsin刺激的DC所诱导的CTL;　　D组:抗原多肽致敏、TNF-α刺激的DC所诱导的CTL;　　E组:抗原多肽致敏、Tuftsin刺激的DC所诱导的CTL;　　治疗结束后处死小鼠，分析比较各组间的肿瘤抑制情况。　　研究结果:　　1）经过流式细胞仪检测DC表型发现抗原多肽联合TNF-α、Tuftsin可以有效的促进CD83的表达，与空白对照组、阳性对照组相比差异显著。无论是sw-480细胞裂解物碎片还是抗原多肽，在联合Tuftsin时都可以提高上清液中IL-12含量，且与空白对照和阳性对照相比有统计学差异，但是sw-480细胞裂解物碎片联合Tuftsin会导致DC上清液中IL-10含量显著上升;　　2）ELISA法检测CTL上清液中IFN-γ含量显示，抗原多肽分别联合TNF-α和Tuftsin都可以显著提高该细胞因子的含量，与其余个实验组相比差异显著。LDH实验表明效靶比分别为5∶1和10∶1时，抗原多肽联合TNF-α、Tuftsin杀伤率较高，与其余组相比差异显著;　　3)裸鼠皮下置瘤模型构建成功，第7天置瘤率即可达到100％;4）裸鼠经3次尾静脉注射治疗后，发现所有实验组与空白对照组相比瘤重都显著减轻，其中抗原多肽联合TNF-α、Tuftsin与阳性对照组相比瘤重下降明显，差异显著，另外抗原多肽抗原肽联合TNF-α、Tuftsin抑瘤率分别达到64.00±18.22％和84.67±12.26％，优于其余组别，差异显著。　　研究结论:　　1）抗原多肽作可以有效的被DC识别、吞噬，从而促进其成熟，上调DCs表面上共刺激分子CD83的表达。Tuftsin可以显著增强DC的吞噬功能，有利于DC功能的表达，分泌更多的正向免疫调节因子。　　2）抗原多肽联合TNF-α、Tuftsin在体外的杀伤肿瘤活性显著优于其余各组。　　3）抗原多肽联合 TNF-α、Tuftsin在裸鼠体内治疗人结肠癌细胞有着显著的效果，相比于传统方法抑制肿瘤生长效果更好。