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目的:利用网络药理学预测瘿肿消软膏治疗结节性甲状腺肿作用机制;根据网络药理学分析结果,从细胞增殖角度探讨瘿肿消软膏对实验性结节性甲状腺肿大鼠疗效机制。材料与方法:第一部分为瘿肿消治疗结节性甲状腺肿的网络药理学研究。通过中药系统药理学技术平台(TCMSP)以类药性(DL)≥0.18为条件,筛选瘿肿消组成药物活性成分及其潜在作用靶点。利用Gene Cards、OMIM数据库检索结节性甲状腺肿疾病靶点,运用Cytoscape软件构建“瘿肿消活性成分-作用靶点”、“瘿肿消各药物活性成分-潜在治疗靶点”关系网络。利用STRING数据库及Cytoscape软件构建靶点蛋白互作网络。通过DAVID及KEGG数据库对瘿肿消治疗靶点进行生物过程及通路富集分析。第二部分为瘿肿消对结节性甲状腺肿大鼠甲状腺细胞增殖作用研究。SPF级4周龄Wistar大鼠50只,雌雄各半,随机选取10只为正常组,其余40只大鼠采用剂量为0.01g/(kg·d)PTU灌胃14天复制甲状腺肿模型,成模后,40只大鼠随机分为模型组、软膏组、湿敷组、LT4组4组,每组10只。第15天起,正常组、模型组大鼠正常饲养,其余各组大鼠用6%硫化钠进行颈部脱毛。软膏组大鼠根据成人用药量换算予生药含量0.9g/(kg·d)的瘿肿消软膏日1次颈部外敷,湿敷组予不含药物成分的软膏日1次颈部外敷。LT4组予0.2μg/(kg·d)LT4水溶液日一次灌胃,连续干预28天。干预结束后,麻醉大鼠,留取血清、甲状腺组织。采用ELISA法检测大鼠血清TT3、TT4、TSH含量,HE染色方法观察大鼠甲状腺组织形态,免疫组织化学法和Western blot法检测大鼠甲状腺组织PCNA、VEGF表达情况。结果:1.(1)在TCMSP数据库,以DL≥0.18为条件,筛选得到瘿肿消8味组成药物227种活性成分,其中夏枯草39种,大黄63种,栀子43种,浙贝母15种,莪术8种,青黛21种,薄荷33种,冰片5种。(2)瘿肿消活性成分作用靶点共计2052个,其中夏枯草555个,大黄241个,栀子496个,浙贝母85个,莪术55个,青黛162个,薄荷452个,冰片6个,删除重复靶点后剩余149个。(3)在Gene Cards、OMIM数据库共找到847个结节性甲状腺肿疾病靶点,药物与疾病交集靶点190个,其中夏枯草49个,大黄18个,栀子48个,浙贝母11个,莪术2个,青黛14个,薄荷45个,冰片3个,删除重复靶点后剩余62个。(4)利用STRING数据库构建治疗靶点蛋白互作网络(PPI),PPI网络包含62个靶蛋白节点,609条相互作用连线,平均节点度为19.6,平均局部聚类系数为0.709。(5)对治疗靶点进行生物过程分析,得到1163条生物过程信息,914条具有显著意义(P<0.01),前20条显著富集通路主要涉及细胞对有机物的反应、代谢过程的调控、细胞增殖调控、细胞死亡调控、催化活性的调节、蛋白质代谢过程的调控、刺激反应的调节等。(6)KEGG富集分析得到瘿肿消潜在治疗靶点相关基因通路128条,其中112条具有显著意义(P<0.01),前20条显著富集通路为PI3K-Akt信号通路、EB病毒感染、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK信号通路、乙型肝炎、前列腺癌、细胞凋亡、麻疹、粘着斑、TNF信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乳腺癌、丙型肝炎、P53信号通路、大肠癌、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、铂耐药、膀胱癌、催乳素信号通路。2.(1)各组大鼠体重无统计学差异(P>0.05)。与正常组相比,各组大鼠甲状腺重量与相对重量显著增加(P<0.01);与模型组相比,湿敷组甲状腺重量与相对重量无统计学差异(P>0.05),软膏组及LT4组甲状腺重量与相对重量显著下降(P<0.01);与LT4组相比,湿敷组甲状腺重量及相对重量显著下降(P<0.01)。(2)正常组甲状腺组织滤泡大小均匀,上皮细胞排列规整,滤泡腔内胶质均匀,可见少量毛细血管。模型组与湿敷组甲状腺组织滤泡大小、形状不规则,差异较大,上皮细胞明显增生,排列紊乱,胶质分布不均,周围毛细血管丰富。与模型组相比,软膏组甲状腺组织滤泡大小、排列相对规整,上皮细胞增生好转,胶质分布较为均匀,滤泡周围毛细血管有所减少;LT4组甲状腺滤泡恢复至中等大小,排列较为规整,滤泡腔内胶质相对均匀,周围毛细血管分布减少。(3)各组大鼠血清TT3水平无显著差异(P>0.05)。与正常组相比,各组大鼠血清TT4均显著降低(P<0.01);与模型组相比,LT4组大鼠血清TT4升高(P<0.05),其余各组无统计学差异(P>0.05);与LT4组相比,湿敷组TT4水平较低(P<0.05)。与正常组相比,各组大鼠血清TSH均显著升高(P<0.01);与模型组相比,LT4组大鼠血清TSH显著降低(P<0.01),其余各组无统计学差异(P>0.05);与LT4组相比,软膏组和湿敷组有显著差异(P<0.01)。(4)对各组大鼠甲状腺组织PCNA阳性表达平均光密度值计算得出:与正常组相比,各组PCNA阳性表达均显著增强(P<0.01);与模型组相比,湿敷组PCNA表达无统计学差异(P>0.05),软膏组和LT4组PCNA表达均显著减少(P<0.01);与LT4组相比,软膏组PCNA表达显著减少(P<0.01)。(5)与正常组相比,各组PCNA蛋白表达均显著增强(P<0.01);与模型组相比,湿敷组PCNA蛋白表达无统计学差异(P>0.05),软膏组和LT4组PCNA蛋白表达显著减少(P<0.01);与LT4组相比,软膏组PCNA蛋白表达显著减少(P<0.01)。(6)对各组大鼠甲状腺组织VEGF阳性表达平均光密度值计算得出:与正常组相比,各组VEGF表达显著增强(P<0.01);与模型组相比,湿敷组无统计学差异(P>0.05),软膏组和LT4组VEGF表达显著减少(P<0.01,P<0.05);与LT4组相比,软膏组VEGF表达显著减少(P<0.01)。(7)与正常组相比,各组VEGF蛋白表达均显著增强(P<0.01);与模型组相比,湿敷组VEGF蛋白表达无统计学差异(P>0.05),软膏组和LT4组VEGF蛋白表达显著减少(P<0.01);与LT4组相比,软膏组VEGF蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:1.网络药理学分析结果显示,瘿肿消软膏可能通过参与细胞增殖、细胞凋亡等过程治疗结节性甲状腺肿。2.瘿肿消软膏可能通过减少PCNA、VEGF表达,抑制甲状腺细胞增殖治疗结节性甲状腺肿。