鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒DHAV引起的一种急性、传播迅速、高发病率和高度致死性传染病,给养鸭业带来了巨大的经济损失。目前,市场上的抗DHAV药物存在较多不足,研发新的抗DHAV药物对鸭病毒性肝炎的防治极其重要。本课题通过MTT法,初步比较筛选出体外具有良好抗DHAV-1作用的中药成分。同时,根据DHAV-1 VP1基因相对表达的动态变化,分析了 DHAV-1的复制周期,并研究了槲皮素和黄芩苷对DHAV-1复制周期的影响。再根据药物的特性和抗病毒活性,对栀子苷进行磷酸化修饰,对槲皮素进行磷脂复合物合成,比较了修饰前后其抗病毒作用。上述研究,可以为鸭肝炎病毒的防控和治疗提供参考资料,也为今后抗病毒药物的研发奠定基础。试验Ⅰ:几种中药成分抗鸭肝炎病毒作用的比较本试验旨在初步比较筛选出具有良好抗DHAV-1作用的中药成分,为后续的试验奠定基础。在本试验中,通过MTT法测得7种中药成分的安全浓度和其体外抗DHAV-1的效果。结果表明,槲皮素和黄芩苷表现出较好的抗DHAV-1作用,其最高的病毒抑制率分别为185.86%和146.37%,木犀草素、高良姜素和橙皮素表现出一般的抗病毒作用,其最高的病毒抑制率分别为71.06%、69.23%、65.67%,而柚皮素的抗病毒作用最差,其最高的病毒抑制率为15.03%。综合评价以槲皮素和黄芩苷、栀子苷效果较好。试验Ⅱ:槲皮素和黄芩苷对DHAV-1体外复制周期的影响本试验旨在探索在DHAV-1复制周期中,槲皮素和黄芩苷体外抗病毒的作用和机制,为鸭肝炎病毒的防控和治疗提供参考资料。本试验中,通过实时荧光定量PCR检测在复制周期中DHAV-1 VPI基因相对表达的动态变化,并通过电子显微镜观察病毒吸附鸭胚肝细胞的形态。基于复制周期的研究,通过设置槲皮素和黄芩香作用的不同时间段,采用实时荧光定量PCR检-测在吸附、复制、释放三个过程中病毒基因相对表达水平。结果表明,DHAV-1在感染90 min后吸附完成,电镜下可见吸附在细胞表面的病毒颗粒。经过约5 h的早期蛋白合成阶段,病毒的复制持续约13 h。而且,DHAV-1的释放在32 h后达到稳定状态。槲皮素和黄芩苷在体外均可以表现出较好的抗DHAV作用,它们不仅可以降低病毒产生的细胞病变,还可以影响病毒的增殖,其中,槲皮素能显著降低复制过程中病毒VP1基因的表达,因而对病毒的复制阶段有抑制作用,具有一定的特异性,而黄芩苷则能显著降低复制和释放过程中病毒VP1基因的表达,对病毒的复制和释放均有抑制作用,范围更加广泛。试验Ⅲ:栀子香磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物的制备及其抗DHAV-1作用本试验旨通过结构修饰,改善栀子苷和槲皮素在生物活性和生物有效性方面的不足,为抗鸭肝炎病毒的药物研发提供资料。在本试验中,通过三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法对栀子苷进行磷酸化修饰,以提高其抗病毒活性;通过溶剂法对樹皮素进行磷脂复合物合成,以提高其生物有效性。同时,采用红外光谱、质谱分析等,对两种修饰物进行了鉴定。此外,还通过MTT法和荧光定量PCR检测并比较了两种修饰物的抗病毒活性。结果表明,成功获得了栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物。其中,栀子苷磷酸化修饰的最佳条件是:pH为8.5,反应温度为70℃,反应时间为4h,而且修饰物中有一个磷酸基团取代了栀子苷的羟基,经过磷酸化修饰后,栀子苷的病毒抑制率从52.63%提高至73.09%,VP1基因表达量显著降低至0.411,其抗病毒活性得到了提高。槲皮素磷脂复合物是与槲皮素和大豆卵磷脂完全不同的一种新物质,它能够在较低的浓度表现出较好的病毒抑制率和抑制病毒VP1基因表达的活性,因而槲皮素磷脂复合物不仅保留了槲皮素较好的抗DHAV-1的生物活性,还具有更好的生物有效性。