论文部分内容阅读
研究背景脂质代谢紊乱和炎症是动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)形成的公认危险因素。肝脏作为机体脂质代谢和炎症控制的重要器官,与As的发生发展密切相关。调节肝脏脂质代谢及炎症是防治As的有效策略。最新研究发现甲硫氨酸残基氧化修饰(甲硫氨酸亚砜)可通过影响某些特定蛋白质的结构与功能,参与多种氧化相关疾病的发生与发展。而MsrA作为机体内一道特殊的蛋白抗氧化防护屏障,可特异性还原S型甲硫氨酸亚砜(Methionine S-sulfoxide, MetSO),在调节蛋白功能及细胞氧还状态平衡的过程中扮演重要的角色。因此,本研究拟将MsrA作为一个调控靶点,干预肝脏氧还状态,观察肝脏hMsrA高表达对As模型鼠炎症、脂质代谢及As斑块的影响并探究其相关机制。方法体外研究：采用脂质体法分别将构建的慢病毒表达载体质粒pWPI-hMsrA-GFP及对照质粒pWPI-GFP瞬时转染传代培养的人肝癌HepG2细胞系,荧光显微镜观察细胞报告基因GFP表达状态,蛋白免疫印迹检测MsrA表达水平。利用透膜荧光探针二氢溴乙啶(氧化转化为溴化乙啶)荧光显微镜下检测细胞红色及绿色荧光,ImageJ软件计算转染细胞的平均荧光强度分析胞内活性氧簇(ROS)的水平;实时定量PCR (Q-PCR)及蛋白免疫印迹检测HepG2细胞炎症和脂质代谢相关基因表达的水平,观察hMsrA高表达对HepG2细胞炎症及脂代谢的影响。体内研究：将慢病毒表达载体pWPI-GFP/pWPI-hMsrA-GFP和包装质粒PCMV/PD2G,通过磷酸钙法共转染293T细胞,包装形成慢病毒颗粒(Lv-GFP/Lv-MsrA-GFP),收集、浓缩获得高滴度慢病毒颗粒浓缩液。先后采用载脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠或清道夫受体BI基因敲除(SR-BI-/-)小鼠作为As模型鼠,各自随机分两组,每组8只,分别经眼球后静脉丛注射pWPI-GFP慢病毒(Lv-GFP对照组)和含hMsrA的重组慢病毒(Lv-MsrA-GFP组)；慢病毒颗粒输注两周后,小鼠采用AIN-76A西方膳食高脂喂养12周,加速As进程。实验小鼠自病毒注射两周后每间隔3-4周采血,酶法监测血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离胆固醇(FC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等血脂水平；快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography, FPLC)分析血浆脂蛋白胆固醇分布；血浆超氧化物歧化酶(SOD)采用试剂盒检测；血浆对氧磷酯酶(PON1)活性利用对氧磷为底物,采用连续动态法监测；异丙醇法抽提粪便脂质并检测粪胆固醇含量。病毒注射14周后小鼠安乐死,从主动脉根部连续冰冻切片及主动脉胸腹段en face剖面进行油红O染色分析斑块面积。采取小鼠肝脏组织行组织化学检测肝脏MsrA表达水平；酶法分析肝脏脂质含量；实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏炎症及脂质代谢相关基因的mRNA水平；蛋白免疫印迹检测肝脏脂质代谢相关基因和血浆中载脂蛋白AI(apoAI)、PON1及血清淀粉样蛋白A(SAA)的蛋白水平。结果1. hMsrA高表达可降低HepG2细胞ROS水平,抑制炎症因子肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素-6(IL-6)的产生,也可显著上调胆固醇代谢相关基因肝X受体α(LXRα)、ATP结合盒转运蛋白Al(ABCA1)及SR-BI的基因表达,但对低密度脂蛋白受体(LDLR)的基因表达未产生明显影响。结果表明高水平hMsrA可通过发挥抗氧化作用,降低ROS水平,影响HepG2细胞炎症及脂代谢相关基因表达。2.GFP荧光检测及MsrA的免疫组化均显示,慢病毒注射可使小鼠肝脏高表达hMsrA,实验中小鼠的体重、脾重及血浆谷丙转氨酶(ALT)活性无明显变化,说明肝脏高表达hMsrA并未对小鼠免疫及肝功能产生明显不良影响。与Lv-GFP小鼠相比,Lv-MsrA-GFP apoE-/-小鼠肝脏MsrA高表达3.4倍;而Lv-MsrA-GFP组SR-BI-/-小鼠肝脏MsrA水平是对照组SR-BIA鼠的2.38倍,即肝脏hMsrA高表达实验动物模型构建成功。3.肝脏hMsrA高表达对高脂喂养apoE-/-小鼠的影响：1)与Lv-GFP组相比,Lv-MsrA-GFP组小鼠肝脏炎症因子TNFa/IL-6的mRNA水平明显下调,血浆抗氧化酶SOD、PON1的活性显著提高,血浆PON1、apoAI的蛋白含量也明显增加,而血浆急性应激蛋白因子SAA水平显著下降；2)肝脏hMsrA高表达可明显降低TC、TG,FPLC分析脂蛋白分布可见血脂水平主要是血浆VLDL/LDL水平的降低,HDL-C并未见显著变化；3)肝脏hMsrA高表达可通过上调肝脏胆固醇代谢相关基因SR-BI、apoAI、LXRa、ABCA1/G8及胆固醇7/27α-羟化酶(CYP7A1/27A1)的表达,并协同调节肝脏胆固醇酯水解酶(CEH)和乙酰辅酶A乙酰转移酶(ACAT)的mRNA和/或蛋白水平,显著增强apoE-/-小鼠肝脏对胆固醇的选择性摄取、转化及胆道排泄,提高粪便胆固醇的含量(增加24.6%),减少肝脏脂质沉积；4)肝脏hMsrA高表达显著下调脂肪合成相关酶：乙酰辅酶A羧化酶a (ACCa)/脂肪酸合成酶(FASN)的mRNA水平,抑制TG合成,降低肝脏及血浆TG含量；5)肝脏hMsrA高表达可显著减缓高脂喂养的apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的进程：与Lv-GFP组相比,Lv-MsrA-GFP组实验小鼠主动脉根部横截面切片的平均斑块面积明显减少(0.50±0.06 vs 0.66±0.06 mm2; P<0.01);胸腹主动脉en face剖面分析结果显示,Lv-MsrA-GFP组小鼠主动脉弓及主动脉斑块面积均明显减小(P<0.01,P<0.05)。上述结果提示：肝脏hMsrA高表达可显著改善apoE-/-小鼠肝脏及循环中的氧还状态,抑制炎症,并促进肝脏胆固醇摄取、转化及胆道排泄,抑制TG合成,从而改善脂质代谢,降低肝脏脂质沉积,阻抑As斑块进程。4.肝脏hMsrA高表达对高脂喂养SR-BI-/-小鼠的影响：1)与Lv-GFP组相比,Lv-MsrA-GFP组小鼠肝脏炎症因子TNFa/IL-6的mRNA水平明显下调,血浆急性蛋白因子SAA水平明显降低,而血浆抗氧化酶PON1的活性显著提高。2)SR-BI-/-小鼠肝脏hMsrA高表达可明显降低血浆TG、FC,提升血浆HDL-C水平,但对血浆TC影响不明显；3) SR-BI-/-鼠肝脏hMsrA高表达也可通过下调ACCa/FASN的表达,抑制TG合成；4) SR-BI-/-鼠肝脏hMsrA高表达不再上调肝脏胆固醇代谢相关基因apoAI、LXRa-ABCA1/G8及CYP7A1/27A1的表达,不改变小鼠粪便/肝脏胆固醇含量；但肝脏hMsrA高表达可通过上调肝脏ACAT、 LXRa、ABCA1及血浆apoAI蛋白水平,与降低高脂喂养SR-BI-/-鼠肝脏和血浆FC水平有关。以上结果证实：肝脏hMsrA高水平改善SR-BI小鼠氧还状态,抑制炎症,并抑制TG合成,降低肝脏/血浆FC比例,但不改变血浆/肝脏/粪便TC水平,原因可能与小鼠SR-BI缺陷无法调节肝脏胆固醇的选择摄取有关。结论MsrA作为胞内一种特殊抗氧化酶,其肝脏高表达可显著降低小鼠肝脏组织局部和机体循环系统的氧化状态,发挥抗炎和调节脂质代谢的作用,从而降低小鼠肝脏脂质沉积,及阻抑动脉粥样硬化斑块的进程。其调脂作用主要涉及：促进SRBI介导的肝脏胆固醇摄取、胆固醇转化及胆固醇胆道排泄而降肝脏/血浆胆固醇水平；降低TG合成,一定条件下协调胆固醇的酯化及胆道排泄过程。总之,肝脏MsrA可有效抗氧化抗炎、改善脂质代谢,有望成为防治动脉粥样硬化相关心血管疾病的重要靶向蛋白。