微孢子虫是一种胞内专性寄生的单细胞真核微生物,能感染几乎所有的脊椎动物和无脊椎动物,目前已鉴定的微孢子虫超过1400种。家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）是最早鉴定的微孢子虫,是家蚕的重要病原之一,其感染家蚕会引发微粒子病,该病既可以水平传播,又可经卵垂直传播,是蚕业生产中的重大病害,每年给蚕桑产业造成的经济损失达上亿元。因此,家蚕微粒子虫是养蚕业中唯一的法定检疫对象。母蛾镜检是蚕业中检测家蚕微粒子虫的主要方法,通过母蛾的感染情况来判断蚕卵是否感染,属于间接检测,依赖于显微镜观察,主观性强,容易出现错检漏检的情况。因此,建立快速、准确、灵敏的蚕卵中家蚕微粒子虫检测方法是家蚕微粒子虫检测工作未来的发展方向。本实验室在前期研究中,构建了核酸侧向层析试纸条法（NALFS）检测蚕卵中的家蚕微粒子虫,该方法具有较高的灵敏度和特异性,并且耗时短,具有很好的应用前景。但该方法检测成本较高,只能定性分析,检测值无法反映蚕卵中家蚕微粒子虫感染量,即无法定量,并且缺乏相应的检测标准,限制了其进一步推广应用。因此,本研究通过制备检测体系中的核心单克隆抗体—FAM单克隆抗体,组装了量子点层析核酸试纸条（Quantum dot nuclear acid lateral flow strips,QNALFS）,节约了检测成本;并结合定量PCR实现了QNALFS检测的初步定量化,最后将QNALFS法应用于实际生产蚕卵样本的检测,为该方法在蚕业生产中实际推广应用奠定了基础。1.FAM单克隆抗体的制备与量子点层析核酸检测试纸条的组装前期研究筛选得到了 9株FAM单克隆抗体杂交瘤细胞系,所得FAM单克隆抗体亚型均为IgG1-κ,以其中的两株细胞注射预处理过的Balb/c小鼠,收集的FAM单克隆抗体腹水效价达到1:1600,000。利用ProteinG抗体纯化柱对获得的腹水进行亲和纯化,富集FAM单克隆抗体后用于量子点试纸条的组装。将各项条件优化后,制备的试纸条具有较好的检测灵敏度及特异性,量子点层析核酸检测试纸条检测LSU阳性质粒时,QNALFS检测灵敏度可达102拷贝/μL;此外,提取了浓度为107个孢子/mL的家蚕微粒子虫基因组DNA,并以依次稀释101～106倍的稀释液为模板进行扩增检测,稀释到105倍的稀释液可以检出,推算出QNALFS检测灵敏度可以达到102孢子/mL,检测值为2.28。因此,将QNALFS检测值＜2.28的样本判断为阴性;当检测不同微孢子虫基因组时,仅能检出N.bombycis基因组DNA,说明本方法具有很好的特异性。同时,克隆了 FAM单克隆抗体的编码基因,并通过对FAM单克隆抗体的轻链和重链的可变区序列分析,在轻链、重链间引入了一段柔性肽,进而构建了 FAM单链抗体稳定表达载体,成功转染至sf9细胞表达。通过Western blotting确证了表达的FAM单链抗体（scFv-FAM）能够正确识别FAM小分子。FAM单链抗体的制备,有利于FAM单克隆抗体的大规模工程化制备,可以进一步降低试剂成本。2.量子点层析核酸试纸条检测初步定量化为了实现QNALFS检测的初步定量化,本研究分别以家蚕微粒子虫LSU基因和极管蛋白2（PTP2）基因为靶标构建了定量PCR检测体系。NbPTP2是一个双拷贝基因,以PTP2基因为靶标的定量PCR检测体系可以较为直观的反应出样本中家蚕微粒子虫的载量,检测PTP2阳性质粒时,基于PTP2基因的定量PCR检测体系灵敏度可达102拷贝/μL。以多拷贝基因LSU为靶标时,检测阳性质粒时灵敏度可达102拷贝/μL。用这两种定量PCR检测体系对家蚕微粒子虫进行检测,LSU定量检测体系检测灵敏度可达101孢子/mL,PTP2定量检测体系灵敏度为103孢子/mL。比较检测数据表明家蚕微粒子虫中LSU拷贝数约为PTP2拷贝数的十余倍,结合PTP2为双拷贝基因,由此可以推算出105/mL的微孢子虫所提取的基因组中,LSU总拷贝数约为106。以梯度稀释的NbLSU阳性质粒为模板（1.0× 102 copies/μL～1.0×109copies/μL）,进行QNALFS检测,对QNALFS检测值与LSU拷贝数分析发现它们呈现显著的指数关系,指数方程为y=0.3457e0.8531x,相关系数R2=0.9835。以上结果表明,可以根据待检蚕卵样本QNALFS检测值推断出样本中LSU的拷贝数,进而对蚕卵样本中家蚕微粒子虫的载量进行估算,实现了 QNALFS检测的初步定量化,并将QNALFS检测值＜2.28的样本判读为阴性样本;QNALFS检测值≥2.28,判断为阳性样本;QNALFS检测值为2.28～12.84,此时样本中病原载量约为102～105个孢子/mL,判断为轻度感染;QNALFS检测值为12.84～404.67,此时样本中病原载量约为105～108个孢子/mL,判断为中度感染;QNALFS检测值＞404.67,判断为病原载量＞108个孢子/mL,判断为重度感染。3.量子点层析核酸试纸条检测的应用从A蚕区收集156个由带毒母蛾所产的卵圈,通过QNALFS法检测蚕卵是否携带家蚕微粒子虫,结合QNALFS检测值和LSU拷贝数的方程,对QNALFS方法进行标定。统计检测结果发现,156个母蛾镜检为阳性的母蛾产的蚕卵中,有9.6%的蚕卵样本为未感染（QNALFS检测值＜2.28）,25%的蚕卵样本为轻度感染（QNALFS检测值:2.28～12.84）,42.3%的蚕卵样本为中度感染（QNALFS检测值:12.84～404.67）,以及23.1%的蚕卵样本为重度感染（QNALFS检测值＞404.67）。此外,对部分蚕卵样本的基因组分别做QNALFS检测和定量PCR检测,发现当待检蚕卵样本中的微孢子虫浓度为102～103/mL时,量子点试纸条对家蚕微粒子虫的检出具有随机性,LSU定量PCR检测体系检测结果更加稳定,QNALFS检测灵敏度略低于定量PCR检测。为进一步探究QNALFS检测蚕卵时带毒合格的判定标准,本研究自制带毒卵并进行了 QNALFS检测,选取检测值为12.19的带毒蚕卵（微孢子虫载量约为105个/mL）,分别按照3%、10%的比例混入正常蚕卵、共同催青饲养,统计群体的存活率、化蛹率、母蛾以及子代带毒率。结果显示,3%混入组和10%混入组的存活率分别为68.75%和54.25%,正常组存活率90%以上,混入组的生存率与对照组相比显著降低;正常组的化蛹率在90%以上,而3%混入组的平均化蛹率为46.67%,10%混入组的平均化蛹率为32.02%,化蛹率均显著降低;最后检测母蛾及后代的微孢子虫感染率发现,3%混入组的母蛾带毒率和子代带毒率分别为55%和27.27%,而10%混入组的母蛾带毒率和后代带毒率更高,分别达到100%和35%。以上结果表明,QNALFS检测值为12.19的带毒蚕卵,以3%、10%的比例混入正常蚕卵共同孵化饲养时,严重影响群体的生存情况。因此,需要进一步对带毒蚕卵样本进行更全面的研究,以确定带毒合格蚕卵的QNALFS判定标准。综上所述,组装的量子点试纸条具有很好的灵敏度、特异性,并且成本较低。通过与定量PCR的联合分析,初步实现了 QNALFS的定量化,使之能够反映蚕卵当中家蚕微粒子虫感染量。自组装的量子点试纸条在成品卵的家蚕微粒子虫检测中有较好的应用前景,但相应的抽样标准以及检测标准还需要更多的实验来确定。