苹果果实SDH基因cDNA片断克隆及其活性调控机理研究

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山梨醇是一种糖醇,广泛分布于一些木本蔷薇科植物中。它是这些木本蔷薇科植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质,起着其它植物中蔗糖的作用。山梨醇还是一种小分子渗透物质,可以改变细胞渗透势,从而可以提高植物抗寒、抗旱、抗盐、抗硼亏缺等方面的能力。酶对山梨醇的代谢途径、代谢场所和代谢速度起关键作用,与山梨醇代谢相关的酶主要有6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)、山梨醇脱氢酶(SDH)和山梨醇氧化酶(SOX)、NAD-山梨醇脱氢酶负责催化山梨醇氧化成果糖的不可逆反应。山梨醇脱氢酶是苹果分解利用山梨醇的关键酶,在调节库强和细胞代谢中具有重要作用,与苹果果实的发育及品质、产量密切相关。   本研究以红富士苹果为试材,克隆了苹果SDH基因的部分cDNA序列。试验结果表明,改良的SDS/酚法能提取出高质量的苹果果实总RNA。通过RT-PCR,获得了一个大约0.4Kb的目的片断,经克隆测序后证实该片断长383bp,编码127个氨基酸。经核苷酸和氨基酸序列同源性分析,该片断与蔷薇科植物中的NAD-SDH有很高的同源性,最高达99%。该片段属于乙醇脱氢酶基因家族,含有一个特征序列G-H-E-X(2)-G-X(5)-[G/A]-X(2)-[I/V/S/A/C]、含锌的乙醇脱氢酶家族典型的保守序列、Zn的催化位点和结构位点、NAD的结合位点等。   对于套袋对苹果果实糖含量和山梨醇代谢相关酶活性的影响,结果表明:在整个发育过程中,套袋苹果果实的蔗糖、葡萄糖和果糖含量及SDH的活性变化趋势与对照基本一致。与对照相比,套袋后,苹果果实的蔗糖、葡萄糖和果糖含量均出现不同程度的降低,而山梨醇含量有一定的增加。套袋处理降低苹果果实的SDH活性,但SOX活性在发育后期有一定的增加。相关分析表明,苹果果实的果糖积累主要与SDH活性密切相关。由此推断,套袋通过降低苹果果实的山梨醇代谢而影响苹果果实的糖积累。   山梨醇脱氢酶是苹果果实中山梨醇代谢的主要酶。在果实的发育过程中,山梨醇脱氢酶的活性均受到山梨醇、葡萄糖、果糖和蔗糖的调控。实验结果表明,果糖抑制山梨醇脱氢酶的活性,其他糖诱导此酶活性的升高。各种糖处理对山梨醇脱氢酶的诱导作用随着培养液中糖浓度的提高而加强。供试激素对果实中的山梨醇脱氢酶也有不同的调节作用,ABA和乙烯利促进山梨醇脱氢酶活性的升高,IAA和GA3抑制山梨醇脱氢酶的活性,发育前期激素对山梨醇脱氢酶的诱导作用显著高于对发育后期果实的诱导作用。
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