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一、研究背景新生隐球菌是一种能够引起隐球菌性脑膜炎等严重致死性疾病的重要病原真菌。隐球菌性脑膜炎治疗棘手,病死率高。其临床结局取决于宿主的免疫状态,巨噬细胞作为天然免疫的第一道防线,与宿主的保护性免疫密切相关。暴露于新生隐球菌后巨噬细胞的状态在受到一些特定因素的刺激后,如细胞因子、细胞间接触物和代谢物等,可表现出高度可塑性。肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）作为机体的一种多功能天然免疫蛋白,既对微生物有直接的抑制或杀伤作用;又在调控机体免疫反应中发挥着重要的角色,可在不同疾病中发挥着抗炎和促炎的效应。基于前期临床芯片数据的m RNA差异性表达谱,我们提出假设:具有免疫调节活性的蛋白PGLYRP1,可能参与巨噬细胞抗新生隐球菌感染的免疫调节过程。二、实验方法1.研究PGLYRP1蛋白在宿主新生隐球菌感染中的表达情况:前期对隐球菌性脑膜炎患者和健康人的外周血单个核细胞（PMBC）进行m RNA表达谱的芯片分析,随后通过实时定量荧光PCR,Elisa法对隐球菌性脑膜炎患者PBMC和血浆中的PGLYRP1 m RNA及蛋白水平进行验证;然后进一步构建新生隐球菌小鼠感染模型,应用Elisa法和免疫荧光技术检测PGLYRP1在新生隐球菌小鼠感染模型中的时空表达情况,以初步明确PGLYRP1是否参与了宿主新生隐球菌感染进程。2.研究PGLYRP1蛋白对新生隐球菌的直接作用:通过采取PGLYRP1蛋白与新生隐球菌直接共孵育实验,使用酶标仪测定新生隐球菌的增殖曲线,台盼蓝检测其活力,墨汁染色检测新生隐球菌荚膜大小以及单克隆形成实验检测菌落负荷,来判断PGLYRP1蛋白对新生隐球菌有无直接抑制或杀伤作用。3.研究PGLYRP1蛋白对体外新生隐球菌感染后巨噬细胞表型的影响:通过采取PGLYRP1蛋白、巨噬细胞以及新生隐球菌共孵育体系。采用单克隆形成实验检测巨噬细胞对新生隐球菌的胞内杀伤、吉姆萨染色检测巨噬细胞的吞噬功能、Elisa法检测巨噬细胞上清细胞因子与趋化因子的释放、实时荧光定量PCR和WB检测胞内细胞因子m RNA和蛋白水平以及流式细胞术检测细胞上清活性氧的产生等,来明确PGLYRP1对巨噬细胞抗新生隐球菌感染时具体发挥的功能。4.研究PGLYRP1在体内对新生隐球菌病感染进程的影响:进一步构建PGLYRP1-KO小鼠。建立PGLYRP1-KO和WT新生隐球菌小鼠感染模型:观察小鼠的生存期、组织菌落负荷（肺、脑）、组织HE和PAS染色切片（肺、脑）以及采用Elisa法对组织上清细胞因子进行检测（肺、脑、脾）,来探究PGLYRP1在体内对新生隐球菌病感染进程的影响。5.研究PGLYRP1蛋白对新生隐球菌感染后巨噬细胞内潜在通路的影响:接着我们通过高通量测序方法,检测PGLYRP1对巨噬细胞在抗新生隐球菌感染中转录组水平的变化,同时对差异性基因进行GO和KEGG的富集分析,以鉴定显著变化的调控通路。6.研究PGLYRP1蛋白对新生隐球菌感染后巨噬细胞内关键通路的作用机制:最后我们采用实时荧光定量PCR验证了显著变化通路相关分子的m RNA水平;采用WB和免疫荧光检测通路关键分子的表达;并通过加入该通路抑制剂,检测巨噬细胞表型的变化,以明确PGLYRP1蛋白在抗新生隐球菌感染时巨噬细胞内关键通路的作用机制。三、实验结果1.宿主新生隐球菌感染PGLYRP1表达结果显示:m RNA表达谱芯片分析提示在隐球菌性脑膜炎患者的PBMC中PGLYRP1基因明显升高。实时定量荧光PCR和Elisa法验证发现患者PBMC和血浆中的PGLYRP1 m RNA和蛋白水平都明显升高。在小鼠感染模型中,相比于PBS对照组,新生隐球菌感染组小鼠PGLYRP1在不同组织内呈现不同时间点的增高。2.体外实验结果显示:PGLYRP1蛋白抑制巨噬细胞内新生隐球菌的胞内复制;PGLYRP1蛋白促进巨噬细胞在抗新生隐球菌感染时促炎细胞因子和趋化因子的产生;PGLYRP1蛋白促进巨噬细胞在抗新生隐球菌感染时活性氧的产生。然而PGLYRP1蛋白对新生隐球菌并无直接的作用;PGLYRP1对巨噬细胞在抗新生隐球菌感染时氮化物的产生、吞噬功能并无显著性的影响。3.体内动物实验结果显示:相较于WT小鼠,PGLYRP1-KO小鼠感染新生隐球菌后生存期明显缩短;HE染色和PAS染色显示更严重的肺部感染以及更多的炎症细胞浸润;肺和脑组织显示更重的菌落负荷;组织上清细胞因子谱检测结果显示PGLYRP1-KO小鼠更偏向于非保护性细胞免疫反应。4.RNA-seq测序以及GO和KEGG富集分析显示,加入PGLYRP1蛋白后,巨噬细胞高表达基因在NF-κB信号通路上显著富集。实时荧光定量PCR结果显示NF-κB通路关键基因如:MMP9、TNF、ICAM1和CD40在PGLYRP1组明显升高。WB结果显示NF-κB信号通路关键分子P65和磷酸化的P65在PLGYRP1组升高。免疫荧光结果显示在PLGYRP1组P65发生核转位。WB结果显示PGLYRP1-KO小鼠肺组织中NF-κB表达与WT小鼠无差异。加入NF-κB抑制剂后,巨噬细胞抗新生隐球菌感染能力下降。四、结论PGLYRP1在隐球菌性脑膜炎中显著高表达,高表达的PGLYRP1蛋白能促进巨噬细胞在抗新生隐球菌感染时促炎细胞因子、趋化因子和活性氧的产生;PGLYRP1在小鼠体内感染进程中发挥着保护性的作用。在机制上,PGLYRP1可能通过调控NF-κB信号通路增强巨噬细胞抗新生隐球菌的天然免疫反应。该研究揭示了PGLYRP1蛋白在巨噬细胞抗新生隐球菌过程中的作用机制,为隐球菌病的免疫治疗提供新的思路,具有潜在的临床转化价值。