目的：Maspin（乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂）是丝氨酸蛋白酶抑制剂超级家族的一个成员，与卵清蛋白、血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-2、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)和骨髓相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有同源序列。Maspin从人正常乳腺上皮细胞获取，并明确为一种抑癌基因。它在正常乳腺上皮细胞中高度表达，却在乳腺癌中减少或缺失[1-3]。他的主要作用是抑制血管生成和抑制癌侵袭和转移。所有的丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制肿瘤侵袭、转移及血管生成的作用都依赖于暴露的活性位点环(RSL)，在构象转变后抑制其目标蛋白酶。有研究证实:Maspin RSL是抑制乳腺癌和前列腺癌细胞迁移和侵袭所必需的。将RSL上p1位点Arg340突变为丙氨酸后，不仅取消了对pro-uPA的粘附，而且削弱了Maspin对pro-uPA裂解和细胞分离的影响[13]。外源性Maspin被发现可以阻止体外血管生成，并与RSL有关[15]。Maspin通过碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子VEGF阻断内皮细胞迁移。但Maspin中RSL是否为体内抑制乳腺癌血管生成、侵袭和转移所需要并未被直接证明。　　 在本研究中，我们构建了一个Maspin活性位点环突变体，并在乳腺癌肺转移裸鼠模型上测试其功能。我们发现，Maspin中RSL的p1位点的突变，Maspin在体内的抑制转移功能缺失，这表明Maspin中RSL是抑制转移功能所需要的。此外，我们证明了内源性Maspin降低了裸鼠移植瘤模型中乳腺癌血管密度，而Maspin突变体扭转了这种抑制血管生成效果。这些发现揭示了一种新的机制，Maspin抑制转移和血管生成的功能是通过maspin RSL实现的，为以Maspin为基础的靶向治疗策略提供一个新的理论依据。　　 材料与方法：　　 一、材料　　 人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB435、年龄在5-6周的雌性裸鼠、多克隆血友病因子Ⅷ抗体。　　 二、主要试剂和来源Eagle培养基(MEM)、Earls Salts（Irvine Scientific公司）、2mM L-谷氨酰胺（Invitrogen Life Technologies公司）、MEM维生素（Invitrogen Life Technologies公司）、非必需氨基酸（Irvine Scientific公司）和抗生素（Omega Scientific公司）、G418新霉素（Invitrogen生命技术公司）、QuikChange(R)位点突变试剂盒(Strategene)、DOTAP试剂(Roche，IN)、Proteinextraction试剂盒(Biochain)、chemiluminescenece试剂（PerkinEcmer LAS公司）、QCMTM24孔细胞侵袭试剂盒（(Chemicon international公司)、多克隆血友病因子Ⅷ抗体（Chemiconintenational公司）、抑制生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(VECTASTAIN(R)ABC试剂盒、Vector Laboratories、Burlingame)。　　 三、方法　　 （一）组织培养MDA-MB435细胞株是从得克萨斯休斯敦MD安德森癌症中心的Jane E.Price博士获得。细胞是在Eagle培养基(MEM)、Earls Salts、2mM L-谷氨酰胺、MEM维生素、非必需氨基酸和抗生素。Maspin和Maspin RSL突变体转染细胞生长与同样的带有添加G418新霉素的培养基。　　 （二）Maspin RSL突变体的构建Maspin cDNA是从人哺乳动物细胞提取的总RNA所扩增，并且克隆到哺乳动物表达载体，pcDNA3。为构建一个特定位点p1R到A Maspin突变体，我们使用QuikChange(R)位点突变试剂盒。pcDNA3-Maspin的扩增，使用了PfuTurbo(R)DNA的聚合酶和两个含突变序列的引物（上游引物:5-GTGCCAGGAGCAGCGATGCAC-3，下游引物:5-GTGCTGCAGGATCGCTGCTCCTGGCAC-3)。经PCR扩增（55℃退火）的18个循环后，PCR反应在37℃下用被DpnI（10单位）处理1小时。纯化的PCR产物被转化为XL1-蓝超级感受态细胞。包含所需突变质粒的一个菌落被选中，而突变序列被测序确认。　　 （三）建立稳定的Maspin-和Maspin RSL突变体转染MDA-MB435细胞野生型Maspin和Maspin RSL突变体结构一起被转染到使用DOTAP试剂的MDA-MB435乳腺癌细胞。稳定的野生型Maspin和Maspin RSL突变体MDA-MB-435转染子被800μg/ml G418选择，野生型Maspin和MaspinRSL突变体的表达通过RT-PCR和蛋白免疫印迹法一同被确认。阳性克隆包含在含400μg/mlG418的MEM培养基中。　　 （四）蛋白免疫印迹分析使用Proteinextraction试剂盒萃取总蛋白，使用来自Piece.A的20μg可溶性蛋白取物的BCA法测定蛋白浓度并转染到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)，可溶性蛋白来自通过10％ SDS/PAGE分解的各提取物。蛋白免疫印迹被表现为抑制Maspin（BD-Pharmingen）并通过被chemiluminescenece试剂被强化。　　 （五）细胞侵袭法侵袭法是通过QCMTM24孔细胞侵袭试剂盒来呈现的。简单地说，野生型Maspin转染和Maspin RSL突变体转染的MDA-MB435细胞生长于包含0.1％胎牛血清(FBS)无血清MEM培养基24小时，并用在PBS中的2mM EDTA收获，再悬浮于每mL添加0.6×106细胞的0.1％FBS的无血清MEM培养基，然后将制备的细胞悬浮液加入到24孔腔室的每个插片，插片覆盖一层薄薄的ECMatrixTM。带有10％FBS的MEM培养基被加入到更低的腔室，并将细胞在37℃下CO2培养箱(5％CO2)培养24小时。侵入进插片并连接到插入膜底部的细胞脱落、裂解，并用CyQuant GR(R)染料在480/520纳米过滤装置中检测。每次侵袭法接种一式三份的每种细胞株并进行两次独立的检测。结果以两次检测的平均数值为准。　　 （六）裸鼠转移瘤实验亲代的、野生型Maspin转染的和Maspin RSL突变体转染的MDA-MB435细胞被用于乳腺癌植入。年龄5-6周雌性裸鼠被作为宿主。细胞培养在如先前描述的MEM培养基中，并用10％的胎牛血清(FBS)进行补充。对于自发肺转移检测，5×105癌细胞被注射进动物左侧第二个乳腺脂肪垫，并且乳腺癌被允许生长7周。癌灶从麻醉的宿主上切除后，测量乳腺癌的和的总量。随后免疫染色的组织样本如下述方式在此阶段被收集。乳腺癌组织切除，随后，动物被再检测4周后处死裸鼠，为通过计算肺表面癌灶进行转移量化而切除肺。　　 （七）免疫组化乳腺癌组织被固定在10％中性福尔马林缓冲液中。然后，为了免疫组化染色，进行5μm切片。多克隆血友病因子Ⅷ抗体在Tris/EDTA抗原修复后，被用于1∶1000稀释，在4℃下过夜。随后漂洗，切片在室温下用山羊抗兔二抗体孵育一小时。漂洗切片，并用一种抑制生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物孵育，然后用二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)染色。测定血管密度，如第一次低倍(×40)显微镜扫描完整乳腺癌部分所述[18]，以确定热点，这是最高新生血管的区域。然后，单独的乳腺癌微血管在高倍(×400)显微镜下计数，以获得一个定义区域内的血管总数，并以三个视野中的平均血管总数作为微血管密度。　　 结果：　　 一、Maspin RSL抑制乳腺癌细胞的侵袭先前研究显示，Maspin中RSL对抑制癌细胞侵袭是十分必要的。在MDB-MA-435乳腺癌细胞中，我们分别转染了Maspin和Maspin突变体(RSLp1点上突变为Ala)（图1A，1B）。通过侵袭实验，我们证实了Maspin RSL四个突变体能够抑制癌细胞的侵袭。与转染野生型Maspin组相比，所有四个Maspin突变体克隆都表现出高度侵袭能力（图2）。　　 二、Maspin RSL对乳腺癌的生长无明显抑制作用为了确定Maspin RSL突变体对乳腺癌生长的影响，我们将转染Maspin RSL突变体的乳腺癌细胞注射入裸鼠体内，并使用MDB-MA-435细胞和转染野生型Maspin的细胞作为对照组。向裸鼠乳腺垫注射上述癌细胞，并培养7周后，切除原发乳腺癌，测量其重量。在Maspin突变体和野生型Maspin注射组之间的乳腺癌重量差异并不明显，尽管这两组相对亲代细胞注射裸鼠的乳腺癌组织重量有着明显的下降（图3）。说明，Maspin有其他靶点在抑制乳腺癌的生长上起重要作用。　　 三、Maspin RSL抑制乳腺癌的转移将亲代MDB-MA-435细胞、野生型Maspin和MaspinRSL突变体细胞注射入乳腺脂肪垫后，培养7周后，切除乳腺癌组织。随后4周内，选取出现肺部自发转移的死亡裸鼠(图4A)。对肺部表面癌病灶计算分析。注射了MaspinRSL突变体细胞的裸鼠，相比野生型Maspin细胞注射组，肺转移明显增加，与注射亲代MDB-MA-435癌细胞的效果类似。这一结果表明，Maspin中RSL对抑制乳腺癌转移作用是必不可少的。　　 四、Maspin RSL抑制乳腺癌相关血管生成肿瘤新生血管为肿瘤生长提供了足够的营养成分，因此，它成为衡量肿瘤生长与转移的十分重要的指标。先前研究表明，外源性Maspin能够抑制血管生成。于是，我们将注射了亲代MDA-MB435乳腺癌细胞、转染野生型Maspin的乳腺癌细胞和转染MaspinRSL突变体的乳腺癌细胞的荷瘤裸鼠中处死，并切除乳腺癌组织，制备切片，并用血友病因子Ⅷ进行免疫组化染色，以观察癌组织新生血管的情况（图5A，5B）。对比亲代MDA-MB435乳腺癌细胞癌灶，转染野生型Maspin MDA-MB-435乳腺癌细胞的癌灶被观察到其中的血管密度下降，而在Maspin RSL突变体乳腺癌中，血管密度恢复到与亲代癌灶血管密度类似的水平（图5C）。这些结果表明，Maspin可以减少乳腺癌相关血管生成，进一步显示Maspin中完整的RSL对于其生物学功能是必需的。　　 结论：　　 1、Maspin RSL抑制乳腺癌细胞的侵袭；　　 2、Maspin RSL对乳腺癌生长无明显抑制作用；　　 3、Maspin RSL抑制乳腺癌的转移；　　 4、MaspinRSL抑制乳腺癌相关血管生成。