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乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤死亡率首位，而转移是乳腺癌病人死亡的主要原因，骨是乳腺癌发生转移的常见部位。深入研究乳腺癌侵袭转移的分子机制和信号转导途径，探索有效的肿瘤标记物，寻找乳腺癌靶向治疗新的分子靶点，对乳腺癌的诊断预测和治疗具有重大意义。骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein, BSP）是一种高度糖基化、磷酸化、硫酸化的多功能非胶原蛋白，属于SIBLING（Small Integrin Binding Ligand, N-linked Glycoprotein）蛋白家族，其主要分布于矿化相关组织，在多种恶性肿瘤中也有异常表达。自1994年Bellahcence首次阐述了BSP在易发生骨转移的人乳腺癌中表达以来，多项研究提示BSP通过与细胞表面整合素（主要是αvβ3）结合，在肿瘤的粘附、增殖、侵袭、骨代谢、免疫反应（炎症和补体逃逸）、血管生成等多个过程中发挥重要作用。整合素是粘附分子的一大类，主要介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间相互的粘附。整合素家族的粘附分子都是由α、β亚单位经非共价键连接而成的异二聚体跨膜糖蛋白。整合素在肿瘤的发生、发展中主要起两个方面的作用：1、介导肿瘤细胞和细胞外基质的粘附，可改变基质的成分，调节基质生物学功能，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移。2、介导信息从细胞外基质向细胞内传递。整合素αvβ3由αv亚基和β3亚基组成，是整合素家族中的重要成员，属于β3亚群。α、β异二聚体的胞外域连接成球形区域，并含有一个二价阳离子结合域，通过此结合域特异性识别配体的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列。αvβ3主要表达于增殖的血管内皮细胞上，是介导内皮细胞与周围组织结合、内皮细胞与肿瘤细胞粘附。而乳腺癌细胞αvβ3的表达在肿瘤的发生发展和侵袭转移中发挥着重要的作用。整合素连接激酶（integrin-linked kinase,ILK）是一个59KD的细胞内信号蛋白，具有Ser/Thr蛋白激酶活性。在活体内，ILK的过量表达能促进增生和肿瘤形成：ILK可以通过依赖PI3-K的方式被整合素和生长因子等激活，从而磷酸化激活PKB,磷酸化抑制GSK-3，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）是信号转到途径中的重要激酶，作为ILK下游主要作用靶蛋白，是ILK/AKT信号转导通路的核心。活化后的AKT重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位，进一步磷酸化激活或抑制其下游的一系列底物，影响肿瘤细胞抗凋亡、增殖、迁移和侵袭等。Gordon等的最新研究证明,BSP过表达增强乳腺癌细胞表面整合素亚基的表达，进而激活FAK-ERK通路，磷酸化转录因子c-Fos,激活AP-1，增强MMP-2，MMP-9和MMP-14表达，最终促进乳腺癌增殖、转移和侵袭。而对具体哪种整合素的影响并未涉及。本课题组的前期研究获得了siRNA重组逆转录病毒稳定感染的乳腺癌细胞系，即BSP基因稳定沉默的乳腺癌细胞株231BO-BSP27和导入无关载体BSP基因正常表达的乳腺癌细胞231BO-Scrambled，同时构建了重组载体pIRES2-hBSP-EGFP和空载体pIRES2-EGFP。前期课题研究已经证明了乳腺癌细胞BSP基因沉默能够抑制ILK/AKT的磷酸化表达，并能抑制AKT下游因子caspase-3、VEGF、CyclinD1的表达。但BSP如何通过细胞整合素受体αvβ3调控下游信号通路，从而影响乳腺癌细胞的增殖迁移能力并不完全清楚。为了深入探讨BSP对胞内信号转导通路的调控作用，本实验以乳腺癌细胞231BO-Scrambled和231BO-BSP27为研究对象，应用Western blotting技术、流式细胞技术和免疫细胞化学技术，观察BSP基因沉默对乳腺癌细胞中αvβ3表达水平的影响，回复BSP基因表达后是否引起乳腺癌细胞αvβ3的表达水平的变化。采用MTT技术和细胞划痕实验检测αvβ3特异性抑制剂LM609对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响；Westernblotting技术检测αvβ3特异性抑制剂LM609对乳腺癌细胞下游信号通路ILK/AKT的影响。本实验的主要研究结果如下：1.与231BO-Scrambled细胞相比，231BO-BSP27细胞中BSP相对表达量明显下调（70.32±2.18）%（P＜0.01），αvβ3蛋白相对表达量明显下调（74.32±1.48）%（P＜0.01）；导入质粒pIRES2-hBSP-EGFP回复231BO-BSP27细胞BSP的表达水平后，αvβ3蛋白的相对表达量有所上调，流式细胞术检测回复量为（40.6±1.58）%。2.外源添加αvβ3的特异性抑制剂LM609处理231BO-BSP27细胞和231BO-Scrambled组细胞，浓度为10ug/ml的LM609使231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞的增殖能力分别降低（44.50±0.92）%和（50.32±1.32）%（P＜0.01）；同时细胞的迁移能力也受到抑制。3.与231BO-Scrambled细胞相比，BSP基因沉默的231BO-BSP27细胞中p-AKT和p-ILK的相对表达水平分别下降（40.53±1.42；P＜0.01）和（49.32±1.05；P＜0.01）。外源添加浓度为10ug/ml的LM609处理231BO-BSP27细胞和231BO-Scrambled组细胞，p-AKT和p-ILK相对表达水平与处理前相比，分别下降（39.38±1.38；P＜0.01），（33.78±1.51;P＜0.01）；结论:本实验通过流式细胞技术、western blotting技术和免疫细胞化学技术初步证明了人乳腺癌细胞中BSP和整合素αvβ3表达水平存在正相关性，即抑制乳腺癌细胞中BSP的表达可引起αvβ3表达水平下调；而回复乳腺癌细胞BSP表达可上调αvβ3的表达。同时探讨BSP不同表达水平的人乳腺癌细胞中整合素αvβ3对ILK/AKT信号通路及细胞生物学特性的影响。