【背景】1.多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)PBDEs是一系列含溴原子的芳香族化合物,根据苯环上溴原子的个数和位置不同,多溴联苯醚总共有209种同分异构体。其最大的用途是作为阻燃剂,在制造过程中被添加到复合材料中去,以提高产品的防火性。目前已广泛地应用于塑料制品、纺织品、电子和电器设备、建筑材料等领域。含有PBDEs的产品在生产、使用和废弃过程中都可能释放PBDEs到环境中,PBDEs在环境中难降解,滞留时间长,可形成持续性的有机污染物,并具有强亲脂增水性、生物累积及生物放大效应。大气、水体、土壤中的多溴联苯醚可通过食物链对人类和高级生物的健康造成危害,也可通过“蚱蜢跳效应”远距离迁移,导致全球污染。近几年环境监测的数据显示环境与人体组织、血液、母乳中的PBDEs水平逐年增高,PBDEs对自然环境与人体健康存在的潜在不良影响一直受到研究者的关注。经研究发现PBDEs在环境中可分解为毒性作用强的低溴联苯醚,导致甲状腺素和性激素分泌紊乱、神经行为改变、学习记忆能力减退、肝脏损伤及诱发恶性肿瘤等;PBDEs能够通过胎盘屏障及乳汁传递至胎儿,影响胎儿的生长发育;已通过动物实验证实孕鼠暴露于PBDEs可以引起子鼠运动、自发行为改变及学习记忆能力下降;新生的动物对于PBDEs的排泄能力比成年的动物差,在年幼的动物体内(包括脑组织)检测的PBDEs浓度比成年的动物高;PBDEs还可导致神经元细胞结构与功能损伤,其毒性作用机制与细胞内氧化应激和DNA损伤等机制有关。因此,欧盟已经全面禁止在电子电气产品中使用溴系阻燃剂,在美国各州先后拟定法案限制溴化阻燃剂的使用,而其他国家包括我国仍在继续大量使用。2.十溴联苯醚(Brominated Diphenyl Ethers-209,BDE-209)BDE-209是一种含十个溴原子的PBDEs,属于高溴类化合物,由于其具有热稳定性好,添加量少,价格便宜等优势,是目前世界范围内生产及使用量最大的一种高溴类阻燃剂。也是我国主要生产和使用的阻燃剂,因此成为我国经济发达区域环境中的主要污染物。越来越多的研究发现BDE-209与其他低溴类一样具有生物毒性,包括神经发育毒性、免疫毒性、内分泌毒性以及致癌性等,母体内BDE-209也可通过胎盘屏障及乳汁传递至胎儿。但也有学者认为BDE-209在体内的代谢快,蓄积低,在常规暴露水平下对机体不造成影响。因此,对于高溴联苯醚类化合物是否造成环境污染和危害人体健康仍有争议,故研究BDE-209的生物毒性是很有必要的。3.神经干细胞(neural stem cells,NSCs) NSCs发现最早、最直接的证据是Stemple1992年从神经嵴分离、鉴定出能产生神经元和雪旺氏细胞的神经嵴干细胞,这些细胞可以自我更新,产生同样的具有多分化潜能的细胞。目前得到普遍认可的NSCs概念是由Mckay在1997年提出的:NSCs是指具有自我更新及增殖分化能力的细胞群,其多向分化潜能可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,并表现相应的特化形态结构、表型和生物学特征。NSCs具有的特点有:①自我维持和更新能力;②增殖分化能力;③具有多向分化潜能;在不同环境和因子的影响下,可以分化成不同类型的神经细胞。NSCs通过两种方式生长,一是对称分裂后形成两个干细胞,另一种是不对称分裂后形成一个干细胞和祖细胞,祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。NSCs在哺乳动物的胚胎期,主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域;成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室脑膜下层,只不过这些细胞平时处于静止状态。NSCs增殖和分化的调控是目前NSCs研究的核心问题,最近的研究资料显示,NSCs增殖、凋亡及分化的调控受多种相关因素的影响,其基因表达的时空方式除受到自身固有的分子程序调控,还受外源性信号调控,包括细胞因子、微环境等多个方面。本课题在前期实验研究的基础上,立足于母胎医学领域,针对环境污染中BDE-209对母婴健康存在危害,研究母源性不同浓度的BDE-209暴露对胎鼠海马NSCs增殖分化与凋亡及子鼠学习记忆能力的影响。第一部分孕期不同浓度十溴联苯醚暴露对子鼠学习记忆能力的影响【目的】取孕一天的SD大鼠每天进行胃灌不同浓度的BDE-209,连续胃灌十四天后常规饲养,产下的子鼠25日龄断乳,通过Morris水迷宫法观察子鼠的学习记忆能力。【材料与方法】1.购SPF级孕一天的SD大鼠,随机将孕鼠分为空白对照组A、花生油组B、实验组C、D、E,每组5只。空白对照组A常规饲养,花生油组B予胃灌等量的精练花生油,实验组C、D、E分别予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精练花生油中进行胃灌。自购买日开始每天上午避光经口胃灌一次,直至孕14天。后继续常规饲养至分娩后25日断乳,每组断乳后随机选取雄性子鼠各20只为为相应的A、B、C、D、E组。2. Morris水迷宫法检测子鼠学习记忆能力。【结果】Morris水迷宫法检测孕期暴露不同浓度BDE-209的子鼠学习记忆能力示:各组潜伏期有随时间变化的趋势(F=71.686,P=0.000),时间因素的作用随着分组不同而不同(F=6.863,P=0.000),分组因素起作用(F=32.352,P=0.000),在第4天的测试中,对照组A与花生油组B均数差别无统计学意义(P>0.05),实验组D、E子鼠的逃避潜伏期较对照组A延长(P<0.05)。【结论】孕期暴露一定低浓度的BDE-209可导致其子鼠学习记忆能力下降。说明低浓度的BDE-209也可产生神经发育毒性效应。第二部分孕期不同浓度十溴联苯醚暴露对胎鼠海马神经干细胞增殖的影响【目的】取孕一天的SD大鼠每天进行胃灌不同浓度的BDE-209,孕十四天时无菌取其胎鼠海马组织,进行体外无血清培养神经干细胞,观察孕期不同浓度BDE-209的暴露对胎鼠海马神经干细胞增殖的影响。【材料与方法】1.购SPF级孕一天的SD大鼠,随机将孕鼠分为空白对照组A、花生油组B、实验组C、D、E,每组5只。空白对照组A常规饲养,花生油组B予胃灌等量的精练花生油,实验组C、D、E分别予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精练花生油中进行胃灌。自购买日开始每天上午避光经口胃灌一次,直至孕14天。2.取孕14天的胎鼠海马组织,体外无血清培养神经干细胞,每天在倒置显微镜下进行细胞形态观察。根据情况7-10天内,以1:2的比例进行传代培养。3.将培养7天后的神经球进行免疫细胞荧光法的神经干细胞鉴定检测,流式细胞术检测神经干细胞的纯度。4.CCK-8法检测培养2代的神经干细胞增殖,每组设6个平行样品。【结果】1.原代培养的海马组织细胞经无血清培养,24h后可见神经球形成,3-5天后神经球逐渐从小到大、由不规则到边缘整齐,单细胞较少。第7天观察神经球可增大至200μm,表面可见单细胞突出呈鱼泡状,折光性强。直径超过200μm时,球中心的颜色开始变黑,随着神经球的增大黑色逐渐加深加宽,折光性逐渐减弱。2.免疫细胞荧光染色,神经干细胞的特异性分子巢蛋白(Nestin)呈阳性表达,DAPI染核发蓝色荧光。3.流式细胞术所测得的神经球中神经干细胞的纯度为98.02%。4.倒置显微镜观察神经干细胞形态,各实验组可见神经球形成的速度较对照组缓慢,神经球胞体较小,边缘不是很规则,周围死细胞较多,并随着孕期暴露BDE-209浓度的增加,上述现象渐明显。5.CCK-8法检测神经干细胞增殖:从各组细胞的A值及生长曲线图可见,各实验组的细胞增殖总趋势较对照组A下降,根据统计分析,对照组A与花生油组B均数差别无统计学意义(P>0.01),其余各组两两之间均数比较差别均有统计学意义(P<0.01)。【结论】无血清培养基培养的胎鼠海马组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,孕期暴露BDE-209可导致胎鼠海马神经干细胞的增殖能力下降,且其增殖能力随孕期BDE-209暴露浓度的增加而降低。第三部分孕期不同浓度十溴联苯醚暴露对胎鼠海马神经干细胞凋亡的影响【目的】取孕一天的SD大鼠每天进行胃灌不同浓度的BDE-209,孕十四天时无菌取其胎鼠海马组织,进行体外无血清培养神经干细胞,观察孕期不同浓度BDE-209的暴露对胎鼠海马神经干细胞凋亡的影响。【材料与方法】1.购SPF级孕一天的SD大鼠,随机将孕鼠分为空白对照组A、花生油组B、实验组C、D、E,每组5只。空白对照组A常规饲养,花生油组B予胃灌等量的精练花生油,实验组C、D、E分别予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精练花生油中进行胃灌。自购买日开始每天上午避光经口胃灌一次,直至孕14天。2.取孕14天的胎鼠海马组织,体外无血清培养神经干细胞,每天在倒置显微镜下进行细胞形态观察。根据情况7-10天以1:2的比例进行传代培养。3.采用流式细胞仪Annexin V-FITC法检测培养2代的海马神经干细胞的凋亡,每组设6个平行样品。【结果】流式细胞仪Annexin V-FITC法检测孕期不同浓度BDE-209暴露后胎鼠海马神经干细胞的凋亡结果示:各实验组的细胞凋亡率较对照组A增高,根据统计分析对照组A与花生油组B均数差别无统计学意义(P>0.05),其余各组间两两之间的均数比较差别均有统计学意义(P<0.05)(n=6, X±S)。【结论】孕期暴露BDE-209可导致胎鼠海马神经干细胞的凋亡率增高,且其凋亡率随着孕期暴露BDE-209浓度的增加而增高。第四部分孕期不同浓度十溴联苯醚暴露对胎鼠海马神经干细胞分化的影响【目的】取孕一天的SD大鼠每天进行胃灌不同浓度的BDE-209,孕十四天时无菌取其胎鼠海马组织,进行体外无血清培养神经干细胞,观察孕期不同浓度BDE-209的暴露对胎鼠海马神经干细胞分化的影响。【材料与方法】1.购SPF级孕一天的SD大鼠,随机将孕鼠分为空白对照组A、花生油组B、实验组C、D、E,每组5只。空白对照组A常规饲养,花生油组B予胃灌等量的精练花生油,实验组C、D、E分别予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精练花生油中进行胃灌。自购买日开始每天上午避光经口胃灌一次,直至孕14天。2.取孕14天的胎鼠海马组织,体外无血清培养神经干细胞,根据情况7-10天以1:2的比例进行传代培养。3.将无血清培养2代的神经球用10%胎牛血清诱导分化,每天在倒置显微镜下进行细胞形态观察。4.用免疫细胞荧光法将诱导分化后第7天的神经干细胞进行分化检测,每组设6个平行样品。【结果】1.倒置显微镜下见诱导分化的细胞大部分贴壁生长,24h后神经球周围出现很多有突起的细胞,并向外延伸,3d后神经球周围伸出的突起增多且呈辐射状延长,7d后延长的细胞间突起相互交联形成网络。2.经免疫荧光染色见:NeuN染色阳性细胞胞质发绿色荧光,胞体三角形、圆形、或锥形等,细胞核较大呈圆形;GFAP染色阳性细胞胞质发红色荧光,胞体长梭形或多角形,有较长的突起,细胞核较小呈椭圆形;DAPI染色发蓝色荧光。3.免疫荧光法检测孕期不同浓度BDE-209暴露的胎鼠海马NSCs分化为神经元及胶质细胞的比例示:各实验组NSCs分化为神经元的比例均较对照组低,根据统计分析对照组A与花生油组B均数差别无统计学意义(P>0.05),其余各组两两之间均数比较差别均有统计学意义(P<0.05)。【结论】无血清培养基培养的胎鼠海马组织神经干细胞具有多向分化能力,经诱导可分化为神经元、神经胶质细胞。孕期暴露BDE-209可降低胎鼠海马神经干细胞分化为神经元的能力,且其分化为神经元的比例随着孕期暴露BDE-209浓度的增加而降低。