论文部分内容阅读
目的:探究TLR4的激活调控BMP7对主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响及其分子机制,为钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease,CAVD）的早期干预及治疗提供理论依据。方法:非CAVD瓣膜组织（non-CAVD组）取自手术治疗的主动脉夹层患者,CAVD瓣膜组织（CAVD组）取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行瓣膜置换术的患者,采用免疫组化和Western blot实验检测non-CAVD组和CAVD组中炎症受体TLR4、骨形态发生蛋白7（BMP7）以及成骨指标Runx2、α-SMA的蛋白表达水平。猪主动脉瓣膜间质细胞（valve interstitial cells,VICs）选取健康家猪处死立即摘取主动脉瓣叶,分离VICs细胞,并采用免疫荧光染色行表型鉴定。采用脂多糖LPS激活VICs细胞TLR4炎症受体后,ALP染色和茜素红S染色实验检测细胞早期及晚期成骨分化能力;qPCR和Western blot实验验证BMP7表达的变化,检测细胞成骨相关基因及蛋白Runx2和OPN的表达情况。此外,猪VICs细胞在成骨培养基诱导下,感染Ad-BMP7腺病毒后,ALP染色和茜素红S染色实验分别检测其对VICs细胞早期及晚期成骨分化的影响;qPCR和Western blot实验检测炎症因子IL-6、IL-8及成骨相关基因及蛋白Runx2和OPN的表达情况。在LPS激活TLR4炎症受体后,采用脂质体转染法将BMP7-siRNA转染VICs细胞,ALP染色和茜素红S染色实验分别检测其对VICs细胞早期及晚期成骨分化的影响;Western blot实验验证细胞TLR4炎症受体、成骨相关指标Runx2、OPN的表达情况,检测非经典成骨信号通路AKT、ERK1/2和经典成骨信号通路Smad1/5/8的磷酸化水平,初步探讨其机制。在体内实验中,采用ApoE-/-小鼠给予高脂饮食来构建CAVD钙化小鼠模型,超声心动图和HE染色验证模型是否构建成功,免疫组化法检测小鼠模型心脏瓣膜组织中TLR4、BMP7以及成骨特异性转录因子Runx2的表达情况。结果:在人瓣膜组织中TLR4、BMP7以及相关成骨标志物Runx2、α-SMA在CAVD组中表达明显高于non-CAVD组。成功分离出原代猪VICs细胞,免疫荧光染色显示α-SMA（+）、vimentin（+）,vWF（-）,细胞鉴定为猪主动脉瓣膜间质细胞。采用脂多糖LPS激活VICs细胞的TLR4炎症受体后,可上调BMP7表达,促进其早期及晚期成骨分化能力,上调Runx2、OPN的基因及蛋白表达;同时,磷酸化的Akt、ERK以及BMP-Smad1/5/8蛋白表达水平均明显增加。猪VICs细胞在成骨培养基诱导下,感染Ad-BMP7腺病毒后,促进VICs细胞早期及晚期成骨分化能力,促进瓣膜间质细胞的炎症反应以及Runx2、OPN的表达。在LPS激活TLR4炎症受体后,干扰BMP7抑制了细胞早期及晚期成骨分化能力,抑制成骨相关蛋白Runx2、OPN的表达,但干扰BMP7对TLR4炎症受体表达没有影响;仅磷酸化的Smad1/5/8蛋白水平明显降低,对磷酸化的AKT、ERK1/2蛋白表达水平没有影响。CAVD钙化小鼠模型构建成功,钙化小鼠模型心脏瓣膜组织中高表达TLR4,BMP7以及成骨特异性转录因子Runx2。结论:TLR4的激活可上调BMP7促进主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,BMP7/Smads信号通路可能在该过程中发挥重要作用。