人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)归属于疱疹病毒乙亚科的巨细胞病毒属,是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒,为dsDNA病毒,直径约200 nm,基因组大小为230~240 kbp。人类是HCMV的唯一宿主。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞体积增大。根据感染的时间,人类巨细胞病毒感染可分为先天感染和后天感染。一般情况下,HCMV原发感染为隐性感染,无明显的临床症状,一经感染终生携带,病毒周期性地从黏膜部位释放。免疫力低下者如器官、骨髓移植病人和艾滋病患者感染HCMV,可导致视网膜炎、肺炎、脑炎等严重致命性疾病。对于孕妇来说,HCMV原发或复发感染均可引起胎儿宫内感染或围产期感染,而导致新生儿畸形、智力低下和发育迟缓等。由于HCMV感染患者大多处于潜伏感染状态;即使HCMV在体内复制活动,也多为无症状性感染。目前又无有效、安全的抗HCMV药物,故对HCMV感染的治疗,仍限于症状性感染时的对症处理。有效抑制病毒复制的药物如更昔洛伟、丙氧鸟苷等已广泛用于HCMV的预防和治疗,但是常会伴有骨髓抑制、肾毒性、特异性CTL反应及耐药性等副作用。因此,研究与制备中和性抗HCMV抗体,开发抗HCMV疫苗,对于HCMV的治疗和预防有着重要的医学价值和社会意义。人巨细胞病毒基因组编码超过200种蛋白,重要的包括结构蛋白pp65、pp150、非毒力蛋白IE1和包膜糖蛋白gB、gH、gcII等。目前,已制备了多个以gB、pp65、1E-1、pp150为抗体的结合表位的抗体,尽管具有较高的结合活性和效价,但是中和活性不高,无法完全阻止HCMV在体内的感染。近期研究发现,人巨细胞病毒使用了两种不同的方式感染成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞。HCMV通过糖蛋白复合物gB、gH/gL/gO、gM/gN感染成纤维细胞,而感染上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞需要附加gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物(gH五聚体)。回顾HCMV疫苗开发的历史也可以发现,早期开发的减毒活疫苗如AD169和Towne,虽然可以诱导获得短暂的中和抗体应答,但不能彻底清除体内病毒,阻止病毒对上皮细胞的感染。而基因检测发现,两者正是缺失了gH五聚体基因。因此,gH五聚体有可能是HCMV中和性抗体的关键靶抗原。本研究拟采用分子克隆和抗体工程技术等技术制备中和性抗HCMV抗体,分别在动物和个体水平检测中和性抗体的特异性,明确gH五聚体可以作为中和性抗体的靶抗原。研究分为以下三个部分:一、兔源中和性抗HCMV单克隆抗体的制备及其特性鉴定本部分研究拟在动物水平检测抗HCMV抗体产生的类型以及中和活性和结合活性的特点。研究首先使用经基因修饰,包含有gH五聚体(gH,gL,pUL128,pUL130,pUL131)的AD169减毒病毒疫苗免疫家兔。再通过细胞融合和特异性筛选鉴定,获得兔源单克隆抗体。使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。采用基因工程技术获得抗体可变区序列。综合抗体特异性检测结果,对抗体可变区基因组进化聚类进化分析。结果显示,成功制备45株抗HCMV兔源单克隆抗体,其中具有中和抗体作用抗体25株。将中和活力是HCMV-HIG的十倍以上的中和抗体作为优选抗体(11/25)。检测发现,8株优选抗体(8/11)识别的抗原是gH五聚体。绝大部分的结合性抗体并不同时具有中和活力,而且其靶抗原多为gB蛋白。基因组分析结果显示,45株单克隆抗体来自于26个B细胞组,组内抗体的抗原结合特性和中和活性较为统一。中和性抗体的HCDR3和LCDR3平均长度为15.9AA和12.3AA,明显长于20个结合性抗体的CDR3均值,13.0AA(P=0.009)和10.9AA(P=0.009)。上述结果提示,以gH五聚体作为抗原表位的抗体,具有较好的中和活性。二、抗HCMV全分子人兔嵌合抗体及人源化抗体的制备及特性鉴定本部分研究旨在利用抗体工程技术,开发与制备中和性抗HCMV抗体。研究采用分子克隆和基因重组的方法,制备人兔嵌合抗体表达质粒。使用人源CDR替换技术,设计并优化兔单抗可变区序列,并制备人源化抗体表达质粒。使用293F真核细胞表达系统,表达全分子抗体。使用亲和层析系统纯化抗体,使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示,成功制备5株人兔嵌合抗体和3株人源化抗体。重组抗体的种属特异性更接近于人,且保持一定的中和活力或结合活力。抗体CDR3基因序列与抗体的特异性、VDJ区基因空间构象以及抗体的表达有直接作用。上述结果表明,可以通过抗体工程技术制备,制备、优化抗HCMV中和性抗体,为相应治疗性抗体的研发奠定理论基础。三、全人源抗HCMV单克隆抗体的筛选、制备及特性鉴定本部分研究的目的是验证感染HCMV的个体中,gH五聚体是其产生的中和性抗体的主要靶抗原。本研究选取高滴度HCMV感染者外周血,使用免疫磁珠筛选获得记忆型B细胞并进行单B细胞培养。设计人源抗体引物,并采用单B细胞PCR技术获得抗体可变区序列。采用抗体工程技术制备与表达全人源抗HCMV抗体,并使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示,成功获得192株全人源抗HCMV抗体,其中中和性抗体21株。15个中和性抗体的靶抗原为gH五聚体,占中和作用抗体总数的71.4%。12个中和性抗体(12/21)的轻链为lambda链,占中和作用抗体总数的57.2%。结果表明,感染HCMV的个体中,大部分中和性抗体的表位为gH五聚体。从高滴度HCMV感染者体内获取全人源高中和性抗HCMV单克隆抗体是可行的。综上所述,不管是使用改良的灭活病毒疫苗免疫家兔,还是对高滴度HCMV感染患者的记忆型B细胞检测,均证实gH五聚体是中和性HCMV抗体重要的靶抗原。开发与制备人源化或全人源中和性抗HCMV抗体的过程中,应注意抗体CDR3基因对抗体功能的影响。