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研究目的:本研究通过体外探讨放疗后胰腺癌细胞上清液中的高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的含量,并进一步探讨其对放疗后残存胰腺癌细胞的增殖和凋亡的影响及其确切机制,从而为胰腺癌的临床精准的诊断、完善的治疗提供有效的实验基础及理论依据。研究方法:(1)光学显微镜拍摄经过不同剂量放疗后残存人胰腺癌细胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)的形态变化。(2)酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同剂量放疗后人胰腺癌细胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)上清液中HMGB1的含量。(3)采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法评价不同浓度的HMGB1对放疗后残存胰腺癌SW1990细胞的增殖活性影响,筛选出最佳作用浓度。(4)采用CCK-8实验观察放疗后上清液对放疗后残存胰腺癌SW1990细胞增殖活性的影响。(5)采用流式细胞术检测放疗后上清液对放疗后残存胰腺癌SW1990细胞凋亡外源性的影响。(6)Western-Blot检测经上清液干预后,放疗后残存胰腺癌SW1990细胞凋亡相关蛋白Bcl2/Bax及Caspase-3、Cleaved Caspase-3和增殖相关蛋白C-myc和Ki67表达的变化。(7)应用荧光定量PCR和Western-Blot检测4种人胰腺癌细胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)中TLR2的m RNA、蛋白相对表达水平。(8)采用倒置荧光显微镜观察sh-TLR2在胰腺癌SW1990中的转染效率,荧光定量PCR和Western-Blot检测sh-TLR2在胰腺癌SW1990细胞中的干扰效率。(9)Western-Blot检测经过HMGB1干预后,放疗后残存sh-TLR2 SW1990细胞中Wnt信号通路中相关蛋白以及增殖、凋亡相关蛋白的表达变化。研究结果:(1)光学显微镜观察到放疗后人胰腺癌细胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)随着放疗剂量的不同,细胞形态发生不同程度的变化。(2)酶联免疫吸附(ELISA)实验结果显示,在10Gy放疗剂量下,胰腺癌SW1990上清液中HMGB1浓度达到最大。(3)CCK-8结果显示随着外源性HMGB1的作用浓度梯度的增加,其对10Gy放疗后残存胰腺癌SW1990细胞增殖活性的促进作用不同,并以HMGB1浓度为100 ng/m L时作用最明显。(4)CCK-8结果显示上液清+EP(Ethyl pyruvate,丙酮酸乙酯,HMGB1释放抑制剂)组、上清液组、HMGB1(100ng/m L)组与PBS组比较,显著促进了10Gy放疗后残存胰腺癌SW1990细胞的增殖活性,并且HMGB1(100ng/m L)组较上清液组的促进细胞增殖能力更加明显。(5)流式细胞术检测结果显示,上清液+EP组、上清液组、HMGB1(100ng/m L)组中早期和晚期凋亡细胞比例明显低于PBS组,同时HMGB1(100ng/m L)组与上清液组比较,前者的早期和晚期凋亡的细胞比例明显减少。(6)Western-Blot结果显示,放疗后残存胰腺癌SW1990细胞经上清液干预后,凋亡相关蛋白Bcl2/Bax及Caspase-3表达下调,而Cleaved Caspase-3表达上调,以及增殖相关蛋白C-myc和Ki67表达上调。(7)荧光定量PCR和Western Blot检测结果显示,SW1990细胞中TLR2表达水平最高。(8)倒置荧光显微镜下结果显示,sh-TLR2组和sh-EGFP组的SW1990细胞均具有高转染效率。荧光定量PCR和Western-Blot检测结果显示sh-TLR2组的SW1990具有高干扰效率,并筛选得到稳定的sh-TLR2 SW1990细胞株。(9)Western-Blot检测经过HMGB1干预后,在放疗后残存sh-TLR2 SW1990细胞中,随着时间的增加,Wnt信号通路中的相关蛋白GSK-3β表达上升,P-GSK-3β(ser9)表达下降,β-catenin表达上升,并且凋亡相关蛋白Caspase-3随着时间的增加而降低,反之Cleaved Caspase-3表达升高,增殖相关蛋白Ki67随着时间的增加而降低。结论:(1)本研究证实在体外胰腺癌SW1990细胞放疗后的上清液中存在HMGB1,与放疗剂量不存在明显的相关性。(2)本研究证实外源性HMGB1和上清液对放疗后残存胰腺癌SW1990细胞具有促进增殖和凋亡抵抗的作用。(3)本研究证实在胰腺癌SW1990中,HMGB1通过TLR2,调控Wnt/β-catenin信号通路,进而调控放疗后残存胰腺癌的增殖和凋亡抵抗。为针对胰腺癌放疗后存在的HMGB1相关作用的临床治疗提供了理论基础。