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由于异常的肿瘤脉管系统和致密的外细胞基质,导致有限的肿瘤灌注和肿瘤免疫抑制性微环境(TME)。为了重塑肿瘤血管并增强抗癌药在肿瘤组织中的渗透,制备了具有“三明治”结构的阴离子脂质体纳米系统。将化学治疗剂拓扑替康(TPT)封装在脂质亲水层,敏化剂吲哚菁绿(ICG)装入疏水层,带正电荷的血管正常化药物厄洛替尼(ERL)吸附在纳米粒最外层。首先,在厄罗替尼作用下,纳米系统通过正常化的肿瘤血管进入肿瘤内部。然后,超声治疗改善血管通透性,使纳米颗粒能穿透血管并到达肿瘤细胞。最后,除细胞毒性作用外,TPT还可以下调HIF-lα蛋白的表达并延长血管正常化作用的时间。本文对药物递送系统的构建、体外抗肿瘤活性、体内分布、药效学及肿瘤微环境改善等进行了系统研究。(1)纳米系统的构建与表征 采用磷脂酰丝氨酸与卵磷脂制备成阴离子脂质体。亲水性化疗药物拓扑替康装入亲水层,可稳定包封药物防止漏药产生副作用。超声敏化剂吲哚菁绿包封在疏水层。这使得声敏剂在发挥血管透化作用的同时,可通过超声敏化诱导的脂质氧化和破坏释放负载的化疗药物TPT。小分子化合物厄洛替尼是一种可逆性的络氨酸激酶抑制剂,可靶向肿瘤细胞,特异性抑制EGFR的表达。由于脂质体中的磷脂酰丝氨酸带有负电,而厄洛替尼的N原子使药物显碱性,两者可发生中和作用。以酸碱形式产生稳定的厄洛替尼负载的纳米颗粒。将厄洛替尼吸附在纳米颗粒外层,可以发挥厄洛替尼作为治疗药物和靶向剂的双重作用。通过紫外可见分光光谱和高效液相色谱考察纳米系统是否成功包载药物;使用激光纳米粒度仪考察纳米药物递送的粒径、电位;透射电镜检测其大小以及形态特征;最后通过模拟体内生理条件考察pH和超声对纳米系统释药的影响。结果表明该TPT/ICG@Lip-ERL纳米系统呈球形,粒径约55nm,电位约-21mV;TPT/ICG@Lip的粒径同样约为55nm,电位约-41mV,电位的变化可初步证明厄洛替尼的成功负载。紫外光谱和高效液相色谱结果也显示纳米系统的成功构建,TPT、ICG和ERL的包封率分别为86.6%、92.3%和96.8%,纳米递送系统加载药物性能好,是良好的药物递送载体。体外释药结果表明,与正常生理条件相比,厄洛替尼在肿瘤微环境酸性和超声条件下的释药率明显增高,可在体循环中发挥肿瘤血管靶向作用,到达肿瘤血管后脱离载体发挥血管正常化作用,而拓扑替康释放明显慢于厄洛替尼可在血管正常化后在超声作用下穿过血管到达肿瘤细胞。(2)体外抗肿瘤活性及抗转移研究 采用转移性的乳腺癌细胞(4T1)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为实验细胞株,通过荧光显微镜法、流式细胞术与多细胞肿瘤球穿透实验,考察了 TPT/ICG@Lip-ERL的细胞摄取、摄取定量分析和系统对多细胞肿瘤样球体的穿透能力。此外,体外细胞毒性实验采用MTT法以考察对4T1细胞的抑制效果;该系统的体外抗血管生成作用通过管形成实验验证;其抗迁移能力可由划痕实验和Transwell进行考察。细胞毒性实验结果表明空白载体Lip安全无毒,生物相容性好;TPT/ICG@Lip-ERL+US组对癌细胞的增殖具有显著的抑制作用,抑制率为82.5%±1.47%,与TPT组相比具有显著性差异(P<0.05),可有效抑制肿瘤细胞。由于载体系统具有良好的肿瘤靶向性及声动力治疗对细胞膜通透性的提高,细胞摄取实验证明纳米递送系统可使更多的药物进入肿瘤细胞。由激光共聚焦实验结果可知纳米递送系统对多细胞肿瘤样球体的穿透能力极强。划痕和Transwell实验结果表明TPT/ICG@Lip-ERL+US纳米递送系统可有效抑制肿瘤的迁移和侵袭。以管形成实验证明:与TPT组相比,TPT/ICG@Lip-ERL+US组可显著抑制肿瘤血管生成。(3)体内分布和成像研究 构建4T1荷瘤小鼠模型,以荧光染料IR783标记载体,通过活体荧光成像仪考察游离荧光染料与其标记的纳米递送系统在动物体内的组织分布情况、离体肿瘤及各主要器官的荧光强度。体内分布结果表明,绝大多数的纳米递送系统积累在了肿瘤组织,而几乎不分布在正常组织器官,肿瘤靶向性较强,毒副作用小,安全性高。(4)体内药效学与肿瘤微环境改善研究 以荷载转移性乳腺癌的雌性BALB/c小鼠为实验动物,测量并记录实验小鼠瘤体积、体重变化,剥离治疗结束后的肿瘤拍照并称重,通过TUNEL免疫荧光和HE病理切片考察纳米递送系统对肿瘤的抑制效果和对小鼠各主要器官产生的与治疗作用无关的不良反应。采用PE标记载体,考察不同治疗组对药物瘤内渗透的影响;通过免疫荧光分析纳米递送系统对肿瘤转移及肿瘤免疫微环境的改善。体内药效学结果表明TPT/ICG@Lip-ERL+US联合血管正常化、声动力疗法和化疗治疗,明显地抑制了肿瘤增长而对其他组织器官无毒副作用;TPT/ICG@Lip-ERL+US组使肿瘤血管正常化、减少肿瘤细胞外基质,有效抑制肿瘤转移,改善肿瘤免疫微环境提高机体自身抗肿瘤能力。本文制备的TPT/ICG@Lip-ERL纳米药物递送系统可同时荷载化疗药拓扑替康和声敏剂吲哚菁绿、血管正常化药物厄洛替尼,并在肿瘤组织响应超声、pH分离,使药物进入肿瘤并促进药物渗透到肿瘤组织的深部,更有效地发挥对肿瘤的生长及转移的抑制作用,并且能够改善肿瘤免疫微环境。