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救必应Ilicis Rotundae Cortex为冬青科冬青属植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮,是岭南地区常用中药,现为2015年版《中国药典》一部收录品种。因具有清热利湿、解毒消肿、消炎镇痛的功效,临床上常用于暑湿发热、跌打肿痛、风湿痹痛、消化性溃疡、心血管系统等疾病的治疗。救必应含三萜及其皂苷类、二萜及倍半萜类、芳香族类、黄酮苷类等化学成分。三萜及其皂苷类是其主要化学成分及活性成分,药理研究表明其具有抗心律失常、抗心肌缺血、抑菌抗炎、抗肿瘤等药理作用。为了综合开发其资源、挖掘其药用价值,本课题对救必应三萜类成分进行了系统的研究,并选择救必应中具有代表性的三萜皂苷类成分长梗冬青苷进行体内代谢转化研究,以期为探明其在体内发挥药效的物质基础提供参考依据。本实验利用硅胶、反相硅胶、葡聚糖凝胶、制备液相色谱等分离纯化技术从救必应茎皮中分离得到25个三萜类成分,结合理化性质及红外光谱、核磁共振波谱、质谱等波谱学手段,鉴定了 24个化合物,它们的结构分别鉴定为:23-hydroxy-3,11-dioxodea-12-en-28-oic acid(1),3β,23-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-O-β-D-glucopyranoside(A)(2),3β,23-dihydroxy-19-oxo-1 1,13(18)-dien-28-O-β-D-glucopyranoside(B)(3),3β,19α,23-trihydroxy-urs-12-en-28-O-β-D-glucopyranosy1-23-acetyl ester(4),3-O-α-D-glucopyranosyl-rotundic acidic-28-O-β-D-glucopyranoside(5),3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-arabinopyranosyl]-3β,19α-dihydroxy-12-en-28-oic acid(6),3-6-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosy 1-(1→2)-)β-D-xylopyranosyl]-3β,19α-dihydroxy-12-en-2 8-oic acid(7),(20β)-3β,23-dihydroxyurs-12,18-dien-28-oic acid(8),3β-O-[β-D-glucuronopyran-osyl-6-O-methyl ester]ilexosapogenin A(9),rotundioic acid(10),mateside(11),19α,23-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 3β-O-β-D-glucuronopyranoside-6-O-methyl ester(12),ilexside Ⅱ(13),pomolic acid(14),28-O-β-D-glucopyranosyl pomolic acid(15),19-anhydro-4-epirotungenic acid(16),3。,23-dihydroxyursa-12,18(19)-dien-28-oic acid 28-β-D-glucopyranosyl ester(17),ilexosapogenin B(18),ilemaminoside A(19),rotungenic acid(20),hedergenin 3-O-β-D-glucuronopyranoside-6’-O-methyl ester(21),oleanolin acid 3-C-β-D-glucuronopyranoside-6’-O-methyl ester(22),gardeniside B(23),3β-[(α-L-arabinopyranosyl)oxy]-19α-hydroxyolean-12-en-28-oic acid(24)。上述 24 个三萜化合物中19个为乌苏烷型:1-8,10-20,5个为齐墩果烷型:9,21-24。其中化合物1-9为新化合物,依次命名为rotundinosides E-M。化合物1为C-3位酮基且C环含α,β-不饱和酮结构的三萜苷元类化合物,该结构化合物在冬青属植物中首次分离得到;化合物2-3为较为稀有的18,19氧化裂环乌苏烷型三萜皂苷类化合物;化合物5为含α-D-葡萄糖结构的三萜皂苷类化合物,含α-D-葡萄糖的苷类化合物在自然界中比较少见,目前还很少有文献报道。化合物11-12,17,19,21-24首次从该植物中分离得到。上述研究结果丰富和补充了救必应的化学成分研究,同时为进一步的生物活性研究奠定了物质基础。三萜及其皂苷成分是冬青属植物的主要化学成分,现代药理研究表明其具有抗癌、抗炎、保肝等多方面药理作用。然而,口服三萜类成分体内血药浓度和生物利用度较低,代谢研究发现其生物转化率高,因此,代谢产物研究对口服用药的三萜类成分尤为重要。2015年版药典规定长梗冬青苷为救必应质量控制的指标性三萜皂苷类成分,含量不得低于4.5%。药理研究表明长梗冬青苷具有降血脂的药理活性,因此,长梗冬青苷是救必应主要三萜类药效成分之一,但有关长梗冬青苷的体内代谢产物研究尚无文献报道。为此,本课题开展了对长梗冬青苷的体内代谢研究。利用UPLC-QTOF-MS/MS分析技术,综合动态背景扣除(DBS)、信息依赖数据采集(IDA)以及多重质量亏损(MMDF)等手段排除内源性物质及背景干扰,快速发现和鉴定目标化合物,结合药物在体内发生I相代谢以及II相代谢转化的规律,共鉴定13个代谢产物。粪便中鉴定代谢产物12个(M1-M8,M10-M13),尿液中鉴定4个(M6,M8,M10,M12),血浆中鉴定2个(M9,M12)。通过对长梗冬青苷代谢产物的鉴定,发现其在体内发生I相代谢反应如脱糖基化反应、氧化反应、脱氧反应、脱氢反应、脱羟甲基化反应;II相代谢反应如葡萄糖醛酸化反应和硫酸酯化反应。长梗冬青苷体内代谢产物具有以下质谱断裂特征:①脱糖基化反应的代谢产物,其MS2级有162 Da的中性丢失碎片;②氧化反应的代谢产物,其MS2级有16Da或者32Da的中性丢失碎片;③葡萄糖醛酸化产物其MS2级有176 Da的中性丢失碎片;④硫酸酯化代谢产物其MS2级有80 Da的中性丢失碎片。本论文建立了一个快速鉴定长梗冬青苷体内代谢产物的方法,探明了其在体内的代谢途径及转化过程,为进一步阐明其口服后体内发挥药效的作用形式奠定了基础,同时为其他类似结构的三萜皂苷类成分代谢研究提供有益补充。