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研究背景及目的人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)不但是宫颈癌发生和发展的重要因素,还与外阴和肛周鳞癌的形成密切相关。在大约70~100%的肛周鳞癌中可以检出高危型HPV-DNA。其中,HPV16是最为常见的高危型HPV。HPV16 E7可参与大多数宫颈癌和某些特定部位上皮肿瘤尤其是头颈部和生殖器等部位鳞癌的成瘤过程。大量临床病理研究证实:在口腔癌、乳腺癌、胃癌等人类多种恶性上皮肿瘤中,HPV16 E7的表达与肿瘤分化低、易发生淋巴结转移以及预后差密切相关。基于HIV改造产生的慢病毒载体由于与其他载体相比具有可容纳较大片段外源性目的基因、转染效率高、将目的基因高效转导、整合入宿主细胞且维持其长期稳定表达、安全性较好和可感染非分裂期细胞等优点,使其在临床及科研领域的体内、外的基因转导方面得到了广泛的应用。为进一步研究HPV16 E7基因的功能,我们构建了携带HPV16 E7基因的慢病毒表达载体。研究方法与结果1.目的基因HPV16 E7的获取为构建携带目的基因HPV16 E7的慢病毒表达载体,我们首先以Caski细胞TotalRNA为模板逆转录合成cDNA,进而以特异性引物扩增出HPV16 E7基因全长序列。2.重组体pLV-3FLAG-E7构建及鉴定目的基因与表达载体各自进行双酶切,酶切产物电泳后进行胶回收,以T4连接酶将目的基因连入表达载体后转化DH5α感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。3. HPV16 E7慢病毒颗粒(Lenti-E7)的构建以携带目的基因的表达质粒pLV-3FLAG-E7、慢病毒结构蛋白质粒pCD/NL-BH、慢病毒膜蛋白质粒pLTR-G共转染293T细胞包装出含目的基因的慢病毒颗粒Lenti-E7。4.病毒颗粒Lenti-E7滴度测定以慢病毒滴度测定试剂盒检测三质粒共转染293T细胞包装出Lenti-E7慢病毒颗粒。根据系列稀释P24蛋白标准品450nm OD值制作标准曲线,根据Lenti-E7病毒颗粒P24蛋白450nm OD值测得该病毒颗粒中P24蛋白浓度,进而计算出病毒颗粒Lenti-E7的滴度为2×108 TU/mL,该滴度已达到后续实验所需标准。5. Western Blot检测3FLAG-E7融合蛋白的表达为检测病毒颗粒Lenti-E7能否成功将目的基因转导入宿主细胞,且目的蛋白能成功表达,我们以病毒颗粒Lenti-E7转染293T细胞,通过Western Blot技术,以FLAG单克隆抗体检测3FLAG-E7融合蛋白的表达。结果显示3FLAG-E7融合蛋白在293T细胞内能成功表达,进而说明携带HPV16 E7基因的慢病毒颗粒Lenti-E7已构建成功。研究结论成功构建出携带HPV16 E7基因的慢病毒颗粒Lenti-E7,且其滴度达到了后续实验的标准,为进一步研究HPV16 E7基因的功能打下了坚实的基础。