第一部分 血清TFPI2基因甲基化在肝细胞癌诊断中的价值研究研究背景：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在全球癌症相关性死亡中排第三位,是导致肝硬化患者死亡的主要事件。尽管近年来在肝癌治疗方面已经取得诸多进展,但肝癌患者的预后和生存情况仍然不容乐观,因为多数肝癌病例在确诊时已经发展到晚期,错过了最佳的治疗时机。目前用于诊断肝癌的方法主要包括血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)和各种影像学技术(腹部超声、CT和磁共振成像等)。然而,AFP和影像学技术各有其自身的局限性。AFP诊断敏感性相对较低,尚有30%～40%的肝癌患者AFP检测呈阴性。影像学技术的检测能力很大程度上依赖于检查者的专业知识、患者肝硬化情况和肿瘤的大小,这使得在肿瘤初始阶段有效和及时地诊断肝癌较为困难。因此,非常有必要开发新的标志物,以提高早期检测和诊断肝癌的水平。在寻找新的标志物过程中,循环游离DNA (cell-free DNA, cfDNA)逐渐成为研究热点。cfDNA是指不含细胞的血浆/血清中发现的细胞外DNA。早在三十多年前就有研究者发现,肿瘤患者血清中cfDNA水平明显高于非肿瘤性疾病患者。此后,越来越多的研究表明,由肿瘤细胞凋亡、坏死和分泌而来的cfDNA可用于包括HCC在内的各种肿瘤的早期检测。血液中cfDNA可以发生多种变化,包括基因突变、微卫星变异、表观遗传学改变以及线粒体DNA突变等。当前研究发现,表观遗传学改变在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。肿瘤特异性基因启动子区的异常甲基化而引起的表观遗传沉默已被证明在肝细胞癌的发生中起着非常重要的作用。已经有报道显示,许多抑癌基因如p16、p15、GSTP1、 RASSF1A、APC和SFRP1等均在HCC患者血清/血浆中发生了异常甲基化,可能作为早期无创性检测和诊断HCC的表观遗传标志物。对cfDNA的甲基化状态进行检测已经成为早期诊断HCC最有前景的方法之一组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2, TFPI2)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂,可以通过抑制纤溶酶和胰蛋白酶介导的基质金属蛋白酶活化而抑制肿瘤的进展、侵袭和转移。既往的研究已经证明,TFPI2是一个潜在的抑癌基因,在多种肿瘤(如结直肠癌)中均可通过发生启动子甲基化而致表达沉默。此外,TFPI2基因甲基化已被证明在结直肠癌患者血清中较为常见,被认为是一个可用于结直肠癌诊断的潜在血清肿瘤标志物。最近,TFPI2被发现是肝癌的抑癌基因,并可通过包括启动子甲基化在内的表观遗传学改变而致表达沉默。目的：本研究旨在探讨HCC患者血清TFPI2基因甲基化的表达规律,研究血清TFPI2基因甲基化在HCC诊断中的潜在价值。方法：本研究入组了2011年7月～2015年6月期间在山东大学齐鲁医院就诊的96例HCC患者、51例肝硬化(1iver cirrhosis,LC)患者、50例慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者和36例正常对照者。HCC诊断依据美国肝病研究学会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》(2010年更新版),LC及CHB诊断依据AASLD发布的《慢性乙型肝炎实践指南》(2009年更新版),我们采用甲基化特异性聚合酶链反应检测并比较了HCC、LC、CHB患者及正常对照者血清样本中TFPI2基因启动子区域的甲基化状态。结果：1.HCC患者血清中TFPI2基因启动子甲基化率(43.8%,42/96)明显高于LC患者(9.8%,5/51；P=0.000)、CHB患者(14.0%,7/50；P=0.000)和正常对照者(13.9%,5/36；P=0.001),提示TFPI2基因甲基化在HCC患者血清中较为常见。2.当用于区分HCC与LC患者时,血清TFPI2基因甲基化的诊断敏感性和特异性分别为43.8%和90.2%,血清AFP(截点值取20ng/ml)的诊断敏感性和特异性为61.5%和94.1%,而两者联合时的诊断敏感性和特异性为77.1%和84.3%。当用于区分HCC与CHB患者时,血清TFPI2基因甲基化的诊断敏感性和特异性分别为43.8%和86.0%,血清AFP的诊断敏感性和特异性为61.5%和88.0%,而两者联合时的诊断敏感性和特异性为77.1%和76.0%。当用于区分HCC患者与正常对照者时,血清TFPI2基因甲基化的诊断敏感性和特异性分别为43.8%和86.1%,血清AFP的诊断敏感性和特异性为61.5%和100%,而两者联合时诊断敏感性和特异性为77.1%和86.1%。由此可见,虽然血清TFPI2基因启动子区域甲基化状态用于诊断HCC的敏感性和特异性均低于AFP,但是两者联合时可以提高血清AFP对HCC的检出率,提示血清TFPI2基因甲基化可作为无创性检测和诊断HCC的潜在标志物。3.TNM分期较晚(Ⅲ～Ⅳ期)的患者血清TFPI2基因甲基化率明显高于TNM分期较早(Ⅰ～Ⅱ期)的患者(63.2% vs 31.0%；P=0.002),并且TFPI2基因甲基化率随着TNM分期的进展增高。TFPI2基因甲基化状态与其他临床病理指标(如患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤个数、乙型肝炎病毒感染和血清AFP水平等)之间没有明显的相关性(P>0.05)。结论：1.TFPI2基因甲基化在HCC患者血清中较为常见,提示血清TFPI2基因甲基化可作为无创性检测和诊断HCC的潜在标志物。2.血清TFPI2基因甲基化在晚期HCC患者中更容易检测到,提示TFPI2基因甲基化或可用于判断HCC患者预后。第二部分 TFPI2基因甲基化在肝细胞癌切除术后预后判断中的价值研究研究背景：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在世界癌症发病率中排第六位,在癌症相关性死亡中排第三位。肝癌的发生是一个极其复杂的多步骤的过程,许多信号通路参与其中,分子机制非常复杂。既往许多研究已经对HCC发生发展过程相关的基因改变进行了描述和报道。除了基因的异常,表观遗传学的改变已被证明在HCC的发生、进展、侵袭和转移过程中起着至关重要的作用。作为一种重要而常见的表观遗传学机制,DNA甲基化可以导致一系列与HCC密切相关的抑癌基因表达沉默。既往研究发现,在外周血或组织标本中的基因甲基化可作为HCC早期诊断或预后判断的生物标志物。组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2, TFPI2)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂,可以通过负向调节纤溶酶和胰蛋白酶活性而抑制基质金属蛋白酶活化和细胞外基质降解,从而抑制肿瘤侵袭和转移。已经有研究证明TFPI2基因是一一个抑癌基因,TFPI2的高表达可以显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭,而TFPI2表达下调能通过改变转移相关基因的表达而促进肿瘤的侵袭和转移。在包括肝细胞癌在内的多种类型的人类肿瘤中均可发现TFPI2基因启动子区甲基化所导致的TFPI2表达减少。在之前的研究中,我们通过在HCC患者血清中检测TFPI2基因启动子甲基化状态发现,在循环中游离的肿瘤DNA中,TFPI2基因甲基化率与HCC患者的TNM分期密切相关,TFPI2基因甲基化率随着TNM分期的进展而增高。基于以上认识,我们推测异常的TFPI2基因启动子甲基化可能与HCC进展及预后密切相关,可能作为判断HCC预后的潜在标志物。目的：本研究旨在通过检测178例HCC手术切除标本中TFPI2基因甲基化状态来评估TFPI2基因甲基化对HCC切除术后患者预后的判断价值,并研究TFPI2基因甲基化与各项临床病理指标的相关性。方法：收集2008年12月～2012年9月于山东大学齐鲁医院接受手术切除的178例肝细胞癌患者的肝癌组织及邻近非肿瘤性肝组织标本。所有HCC患者均经手术病理证实,诊断依据美国肝病研究学会(American Association for the Study of Liver Diseases, AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》(2010年更新版)。178例HCC标本及邻近非肿瘤性肝组织标本用于进行甲基化特异性PCR检测TFPI2基因甲基化状态,随机选取20例HCC标本及对应邻近非肿瘤性肝组织,并收集20例正常肝组织标本,用于实时定量PCR检测TFPI2 mRNA水平。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较不同甲基化状态的HCC患者生存时间。多因素分析采用Cox比例风险模型进行,研究影响HCC患者术后总体生存率(overall survival, OS)、无病生存率(disease-free survival, DFS)和早期肿瘤复发(early tumor recurrence, ETR)的预后因素。结果：1.178例肝细胞癌组织中有80例(44.9%)检测到TFPI2基因甲基化,而对应邻近非肿瘤性肝组织中只有19例(10.7%)检测到TFPI2甲基化,20例正常肝组织中只有1例(5.0%)检测到TFPI2甲基化。HCC肿瘤组织中TFPI2基因甲基化率明显高于对应邻近非肿瘤性肝组织(χ2=52.064,P<0.001)和正常肝组织(χ2=11.867,P=0.001)。2.从178例HCC样本及对应非肿瘤性肝组织中随机选取20例,并收集20例正常肝组织采用实时定量PCR技术检测TFPI2 mRNA水平。HCC肿瘤组织中TFPI2 mRNA水平明显低于对应非肿瘤性肝组织(Z=4.626,P<0.001)和正常肝组织(Z=5.416,P<0.001)。3.通过比较TFPI2甲基化组(n=80)和非甲基化组(n=98)的各项临床病理指标来评价TFPI2基因甲基化的临床病理意义。结果显示TFPI2甲基化与肿瘤TNM分期明显相关(P=0.004),58例TNM分期较晚(Ⅲ+Ⅳ期)的患者中有35例(60.3%)观察到TFPI2甲基化,而120例分期较早(Ⅰ+Ⅱ期)的患者只有45例(37.5%)观察到TFPI2甲基化。TFPI2甲基化状态和其他临床病理指标,如患者的性别、年龄、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、血清甲胎蛋白水平、肿瘤数目和大小、肝硬化、肿瘤分化程度、门静脉侵袭等均无显著的相关性(P>0.05)。4.发生TFPI2甲基化的HCC患者术后的总体生存率和无病生存率明显比未发生TFPI2甲基化的患者差(P<0.001)。单因素分析显示,肿瘤大小、严重门静脉侵袭、早期肿瘤复发、TNM分期和TFPI2甲基化状态显著影响HCC患者的术后生存(P<0.05)。采用多因素分析来研究在其他预后影响因素存在的情况下TFPI2甲基化状态与HCC患者术后生存的相关性。结果表明,TFPI2甲基化(P=0.002)、TNM分期(P=0.000)和早期肿瘤复发(P=0.000)是影响HCC患者术后OS的独立预后因素,并且TFPI2甲基化(P=0.000)和TNM分期(P=0.015)也是影响HCC患者术后DFS的独立预后因素。如果只选取158例HBV感染的HCC患者作为研究对象,将HBV病毒载量纳入研究指标,单因素分析发现HBV病毒载量、肿瘤大小、严重门静脉侵袭、早期肿瘤复发、TNM分期和TFPI2甲基化显著影响HBV相关性HCC患者的术后生存(P<0.05)。多因素分析显示,TFPI2甲基化(P=0.002)、HBV病毒载量(P=0.015)、TNM分期(P=0.000)和早期肿瘤复发(P=0.000)是影响HBV相关性HCC患者术后OS的独立预后因素。5.61例(34.3%)HCC患者术后发生了早期肿瘤复发,早期肿瘤复发与肿瘤数目、TNM分期和TFPI2基因甲基化明显相关(P<0.05)。80例TFPI2甲基化患者中有38例(47.5%)出现早期肿瘤复发,而在98例TFPI2未甲基化的患者中只有23例(23.5%)出现早期肿瘤复发,差异有统计学意义(P=0.001)。对上述影响早期肿瘤复发的指标进行多因素分析发现,TFPI2基因甲基化是判断肝癌切除术后早期肿瘤复发的独立预后因素(HR=2.295,P=0.002)。如果只选取158例HBV感染的HCC患者作为研究对象,将HBV病毒载量纳入研究指标,单因素分析发现肿瘤数目和TFPI2甲基化与HBV相关性HCC患者早期肿瘤复发密切相关(P<0.05),多因素分析显示TFPI2甲基化仍是HBV相关性HCC患者术后早期肿瘤复发的独立预后因素(HR= 2.448, P= 0.001)。结论：1.HCC患者肿瘤组织中TFPI2基因甲基化较为常见,可导致TFPI2 mRNA水平下调。2. TFPI2基因甲基化提示HCC患者肿瘤分期较晚、早期肿瘤复发和预后差的可能性大,可作为一个判断HCC患者肝切除术后预后情况的潜在标志物。