背景:热休克蛋白90(heatshockprotein90，HSP90)普遍存在于真核和原核细胞中，是一组高度保守的分子伴侣。研究证实，在多数恶性肿瘤组织中HSP90呈高表达状态，在正常组织表达很低，目前HSP90已成为肿瘤治疗的新靶点，其抑制剂也成为抗肿瘤研究的热点。17-AAG是目前研究最多的HSP90抑制剂，已进入Ⅲ期临床试验。17-AAG可竞争HSP90ATP结合位点，HSP90内源性ATP酶活性被抑制，导致HSP90作用的底物蛋白不能与其结合而失去稳定性，从而被蛋白酶水解。在体内外抗肿瘤活性上17-AAG显示出很好的效果，因而被广泛关注。但关于17-AAG作用于食管鳞癌细胞的研究报道不多。　　 HSP90底物蛋白众多，其中很多是细胞信号传导通路的关键蛋白，在肿瘤的发生和演进中起重要作用。在HSP90众多的底物蛋白中，survivin是重要的一员。它是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的新成员，是目前发现最强的凋亡抑制蛋白，在人的胚胎组织和几乎所有人类常见恶性肿瘤组织中高表达，而在健康成人组织和终末分化组织表达水平很低，提示其与肿瘤的形成密切相关。近年来survivin也成为人们关注的抗肿瘤靶点。研究表明通过抑制其表达可有效地破坏肿瘤细胞的生存、发展，诱导其凋亡并降解。YM155是目前研究最成功的survivin的小分子拮抗剂，已进入Ⅱ期临床试验阶段。YM155通过抑制survivin基因启动子活性，抑制肿瘤细胞的生长增殖能力。目前YM155已在非小细胞肺癌、黑素瘤等肿瘤临床试验中取得一定效果，但对食管鳞癌细胞作用的相关报道很少。　　 目的:本研究通过观察17-AAG和YM155单独及联合作用于食管鳞癌细胞株TE-1，旨在探讨两种不同用药方法在体外对细胞增殖、凋亡的影响以及HSP90和survivin在蛋白水平上的变化并分析其可能作用机制，为17-AAG、YM155在食管鳞癌治疗中单独及联合临床应用提供实验依据。　　 方法:　　 1.细胞培养　　 用于实验的食管鳞癌细胞株TE-1由河北医科大学第四医院科研中心提供，细胞以含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中常规传代培养。　　 2.MTT法检测细胞增殖活性　　 分别以不同浓度的17-AAG、YM155单独及联合应用分别处理TE-1细胞，以不含药物的TE-1细胞为对照组，作用细胞24h、48h、72h后，检测对细胞增殖的抑制率。　　 3.流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率　　 流式细胞术PI单染的流式细胞学方法定量分析对照组和经不同浓度的17-AAG、YM155单独及联合应用分别处理TE-1细胞48h后的凋亡率。　　 4.蛋白免疫印迹(Westernblot)检测HSP90和survivin蛋白表达水平　　 对照组和不同浓度的17-AAG、YM155单独及联合应用分别处理TE-1细胞后48h后，提取细胞总蛋白，采用westernblot方法，检测其HSP90和survivin蛋白的表达水平。　　 5.统计　　 采用SPSS16.0软件进行统计分析，所有数据用(x)±s表示，对照组和单独用药组各组间均数比较应用单因素方差分析，联合用药组与单独用药组各组间均数比较应用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。　　 结果:　　 1.MTT结果显示:　　 17-AAG、YM155(以终浓度0.02μM、0.2μM、2μM、20μM和40μM的17-AAG和终浓度0.01nM、0.1nM、1nM、10nM和100nM的YM155)单独作用于TE-1细胞24h、48h和72h后，随着药物浓度的增加分别在24h、48h、72h抑制率逐渐增强，差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.1、2;Table1)，且呈时间和剂量依赖性。　　 17-AAG、YM155(以终浓度0.2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度20μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155)联合作用于TE-1细胞24h、48h和72h后，比单独用药组对TE-1细胞的抑制率明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.3-5、Table1、Table2-4)，提示两者联合用药抑制增殖作用强于单独用药。　　 2.流式细胞术结果显示:　　 单独应用17-AAG和YM155(以终浓度0.2μM、2μM和20μM的17-AAG和终浓度0.1nM、1nM和10nM的YM155)作用于TE-1细胞48h后，随着药物浓度的增加其凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.6、7;Table5)，且呈剂量依赖性。　　 联合应用17-AAG和YM155(以终浓度0.2μM17-AAG和终浓0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度20μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155)作用于TE-1细胞48h后，联合用药组分别比单独用药组对TE-1细胞凋亡率明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.6-8;Table6)。提示联合用药促凋亡作用强于单独用药。　　 3.Westernblot结果显示:　　 不同浓度的17-AAG和YM155单独作用于TE-1细胞48h后，结果显示:两种药物各个浓度组之间的HSP90/GADPH灰度比值差异均无统计学意义(P＞0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)。分别以终浓度0.2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度20μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155联合作用TE-1细胞，结果显示各联合用药组与单独用药组之间的HSP90/GADPH灰度比值差异均无统计学意义(P＞0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table8)。　　 不同浓度的17-AAG和YM155单独作用于TE-1细胞48h后，结果显示两种药物各浓度组之间的Survivin/GADPH灰度比值差异有统计学意(P＜0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)，且随着药物浓度的增加，灰度比值逐渐降低，呈剂量依赖性。分别以终浓度0.2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度2μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155，终浓度20μM17-AAG和终浓度0.1nM、1nM、10nM的YM155联合作用TE-1细胞，结果显示各联合用药组与相应单独用药组之间Survivin/GADPH灰度比值差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table9)。联合用药组的灰度比值明显低于单独用药组，提示联合用药比单独用药更能下调survivin蛋白表达。　　 结论:　　 1.17-AAG、YM155均能有效抑制TE-1细胞的增殖活性，且二者对TE-1细胞的增殖活性抑制作用均呈时间和剂量依赖性。　　 2.17-AAG、YM155联合应用比较单独应用，对TE-1细胞增殖活性有更强的抑制作用。　　 3.17-AAG、YM155均能促进TE-1细胞的凋亡，且二者对TE-1细胞的促凋亡作用均呈剂量依赖性。　　 4.17-AAG联合YM155对TE-1细胞有更强的促凋亡作用。　　 5.17-AAG、YM155单独及联合应用对TE-1细胞HSP90蛋白表达均无明显影响。　　 6.17-AAG、YM155均能下调TE-1细胞survivin蛋白的表达，且呈剂量依赖性。二者联合对TE-1细胞survivin蛋白的表达下调作用更明显。