论文部分内容阅读
[背景]腰背痛的发生大多与椎间盘退变疾病的发生有关,预防和治疗椎间盘退变的疾病有重大的意义。近来有学者发现髓核间质干细胞(NPMSC)存在于椎间盘中,这种干细胞对椎间盘微环境的适应性,对应用组织工程治疗椎间盘退变有重要意义,但椎间盘退变的过程并没有发生逆转或者明显抑制,NPMSC在椎间盘退变中所产生的作用机制还有待探索。炎症因子是促进椎间盘退变的因素之一本文通过将IL-1β作用于NPMSC以研究其生物学特性变化,为NPMSC的进一步体内试验应用提供依据。[目的]研究炎症因子IL-1β对大鼠髓核间质干细胞细胞生物学特性的影响。[方法]取3月龄雄性SD大鼠3只,取其脊柱腰段椎间盘髓核组织,用胶原酶,胰酶序贯消化法分离并培养细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型CD24,CD34, CD45, CD90, CD105表达；利用RT-PCR检测干细胞多能基因SOX2, Nanog的表达。通过体外诱导分化培养观测髓核间质干细胞成脂、成骨、成软骨分化能力。设置IL-1β梯度作用浓度,使用CCK-8检测工L-1β作用于髓核间质干细胞效果并筛选其最佳作用浓度及时间。采用最佳作用浓度,设实验组与对照组,利用流式细胞术检测IL-1β作用于髓核间质干细胞后的凋亡率；荧光定量PCR检测IL-1β作用于髓核间质干细胞后SOX9,蛋白多糖,Ⅱ型胶原酶,caspase-3的基因表达变化。[结果]我们体外分离培养出的细胞电子显微镜下观察为纺锤样长梭形；通过流式细胞仪检测所培养细胞表面免疫标志后发现：CD90、CD105表达阳性,CD45、CD34、CD24表达阴性；利用RT-PCR检测其可表达干细胞基因SOX2, Nanog;诱导分化培养后发现其具有成骨和成软骨分化能力,成脂分化能力较差。CCK-8检测结果：IL-1β可以抑制NP-MSC的增殖活性,与作用时间、作用浓度存在一定的依赖关系,并筛选出最佳作用时间为48H,最佳作用浓度为50ng/ml;流式细胞仪检测凋亡比率结果：实验组为(8.5±0.15)%高于对照组(2.1±0.12)%；实时荧光定量PCR结果显示；SOX9,蛋白多糖,Ⅱ型胶原的mRNA表达下调,caspase-3表达上调。[结论]IL-1β具有抑制NP-MSC的增殖活性并诱导其凋亡的作用,是导致椎间盘自身干细胞无法发挥修复作用的原因之一。