目的:棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的经济作物和天然纤维的主要来源,在国民经济中占有重要地位。棉花在生长过程中经常会受到各种生物和非生物的胁迫导致棉花减产,如冷害、干旱和病虫害等。由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是影响世界棉花生产最为严重的病害,被称为棉花的“癌症”。提高棉花品种对黄萎病菌抗性是防治黄萎病最经济和最有效的方法。由于陆地棉缺乏黄萎病抗源,常规育种手段很难解决其抗病难题。因此,开展棉花抗黄萎病分子机制研究,对利用基因工程手段提高陆地棉对黄萎病抗性具有重要意义。方法:(1)本研究利用转录组测序(RNA-seq)技术,对陆地棉中抗黄萎病品种石大陆抗-1(SD)和感黄萎病品种军棉1号(JM)之间差异表达基因进行挖掘,并对其中受黄萎病菌诱导表达的基因所涉及的相关通路进行了注释,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选抗病候选基因。(2)分析了SD和JM接种黄萎病菌后不同时间点的差异表达基因,利用Blast2GO和KOBAS 2.0软件分别对黄萎病菌诱导的差异表达基因进行了KEGG和GO富集分析。(3)利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、病毒诱导基因沉默(VIGS)和其它生理生化方法,揭示Gh4CL30调控棉花抗黄萎病的机制。(4)通过VIGS、RNA干扰(RNAi)、RNA-seq和其它生理生化方法,阐明GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病反应中的作用。结果与结论:(1)在未接种黄萎病菌的陆地棉抗感品种SD和JM之间鉴定了6831个差异表达基因,其中2866个基因在SD中高表达,3965个基因在JM中高表达。在这些差异基因中,有3685和3239个基因分别在SD和JM中受黄萎病菌诱导差异表达,表明SD和JM之间大部分的差异表达基因都参与棉花对黄萎病菌侵染的应答。根据接种黄萎病菌后不同时间点的表达谱,对这6831个差异基因进行WGCNA分析,共鉴定了23个核心抗病候选基因。(2)SD和JM在接种黄萎病菌不同时间点(12、24和48 h)与未接菌(0 h)相比,分别检测到2010和1275个差异表达基因。GO功能富集显示,SD和JM中的差异表达基因都主要参与单一生物代谢过程和氧化还原过程。KEGG功能富集分析结果表明,苯丙氨酸代谢、单萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成、二萜生物合成和植物昼夜节律的基因都在SD和JM中富集,而苯丙烷生物合成途径和植物激素信号转导只在SD中富集。研究发现大量木质素合成相关基因在SD和/或JM中被黄萎病菌诱导上调表达。此外,13个植物激素信号转导相关基因在SD和/或JM中被诱导,这些基因涉及水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和油菜素类酯信号通路。(3)qRT-PCR分析表明Gh4CL30在棉花茎中优势表达,并在抗感材料根和茎中受黄萎病菌诱导上调表达,表明Gh4CL30可能参与棉花对黄萎病的抗性。利用VIGS技术抑制Gh4CL30在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性显著提高。抑制Gh4CL30表达降低了黄酮、总木质素和S单体含量,却增加了G单体含量和G/S的比值。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中SA和JA含量及信号通路相关基因的表达均被显著抑制,这表明Gh4CL30沉默植株对黄萎病抗性的提高可能不依赖于SA和JA信号通路。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中咖啡酸和阿魏酸含量增加,进一步研究发现,外源添加咖啡酸和阿魏酸可以显著抑制黄萎病菌菌丝生长。以上结果表明,抑制Gh4CL30表达可以增强棉花对黄萎病菌的抗性,这可能与木质素组份改变以及咖啡酸和阿魏酸的积累有关。(4)在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉中分别鉴定得到5、5和10个WRKY70基因。进化分析结果显示,棉花WRKY70转录因子是AtWRKY70的同源蛋白。在每个GhWRKY70基因启动子中至少都包含了一种激素响应顺式元件。GhWRKY70D13在根和茎中的表达高于其它组织,同时该基因受黄萎病菌诱导上调表达。利用VIGS和RNAi的方法抑制GhWRKY70D13的表达提高了棉花对黄萎病的抗性。比较转录组学和qRT-PCR分析发现抑制GhWRKY70D13的表达导致ET和JA合成和响应基因的表达被激活。此外,GhWRKY70D13-RNAi植株中1-氨基环丙烷-1-羧酸、JA和茉莉酸异亮氨酸的含量均显著高于野生型植株。以上结果表明,抑制GhWRKY70D13能激活ET和JA信号通路,从而提高GhWRKY70D13抑制表达植株对黄萎病菌的抗性。