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前言 随着现代社会的发展,竞争日趋激烈,生活节奏日益加快,抑郁症的发病率进一步增加。且每次复发后,人的应对能力及生活质量方面均会有所下降,其社会负担正在不断增加,尤其是其高自杀风险更是引起了人们的广泛关注,所以对该病的发病机制研究越来越受到医学界的重视。应激性生活事件是抑郁症的明显促发因素,且抑郁症患者海马存在与慢性应激大鼠相似的整体形态的改变。因此以应激制作抑郁症动物模型,其发病机理可能与人类抑郁症更接近。 应激是指机体受到各种应激原的刺激时,出现的以交感神经兴奋和下丘脑—垂体—肾上腺皮质(HPA)分泌增多为主的一系列神经内分泌反应,以及由此引起的各种功能和代谢的改变。在中枢神经系统中,海马是与认知行为功能密切相关的重要脑区,由于富含糖皮质激素受体(GR),所以,在应激时海马极易受到高浓度GC的攻击。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养素(NTs)家族的成员之一,BDNF作用广泛,它能增强突触联系,影响神经元的可塑性和神经递质、神经营养因子的合成,且与长时增强效应(LTP)及学习、记忆功能有关。本研究以BDNF的表达作为神经元损害和保护的标志,旨在研究慢性综合应激所致的抑郁症模型大鼠海马神经元活性的改变;探讨大鼠在慢性应激时,BDNF的表达与海马结构和功能改变的关系;帮助提示抑郁症的发病机制,为临床上对抑郁症开展病因学治疗以及新型抗抑郁药物的开发提供理论依据。 材料和方法 一、实验材料 1、实验动物 采用青年雄性Wistar大鼠20只,体重210-240g。由中国医科大学实验动物中心提供。 2、主要试剂 兔抗大鼠BDNF多克隆抗体,生物素标记的山羊抗兔IgG,SABC(链霉素过氧化物复合物)免疫组化试剂盒,DAB显色剂,以上试剂均购于Boster公司。 3、主要实验仪器YSD一4G型药理生理实验多用仪(安徽蚌埠医学院无线电二厂);MetaM0rp丫Cool Snap犷A沉70计算机图像分析系统。 二、实验方法 1、动物分组 大鼠适应环境一周后采用旷场分析法测定行为并称重。然后随机分为对照组8只和实验组12只。 2、应激过程 实验组12只大鼠,分笼喂养,每笼1只。实验第1一21天,接受各种不同的应激:电击足底、冰水游泳、摇晃、夹尾、热应激、禁食、禁水。每天给予1种刺激,每种刺激累计使用2一3次。 对照组8只大鼠,放人二笼中群养,实验第1一21天,不给任何刺激。 3、灌流取材与切片 实验第22天杀死所有大鼠,无论实验组还是对照组大鼠于第22天处死前再次测定行为并称重。每只大鼠用戊巴比妥钠行腹腔麻醉后,经左心室快速灌注37℃生理盐水200而,继之灌注4℃的4%多聚甲醛溶液300nil,然后剥离脑,后固定48小时以上;梯度乙醇脱水,石蜡包埋后,行冠状切片。 4、免疫组化法检测BDNF蛋白 采用免疫组化ABC法检测切片中的BDNF蛋白。 5、图像分析 每只大鼠选取海马较完好的切片1张,在计算机图像分析系统上分别测量双侧海马CAI、CAZ、CA3、CA4、区和齿状回(DG)内BDNF阳性细胞的相对切面面积比和平均光度值。 6、统计学处理 采用SPSSI 1 .5统计软件对数据进行分析。实验结果 1、体重和开场行为评定 实验前实验组与对照组在体重和开场行为指标上无差异。21天后,实验组与对照组相比,体重明显下降、中央格停留时间延长、水平穿越格数减少、直立次数减少、修饰次数减少、粪便粒数增多。 2、光镜下的海马神经元 光镜下观察,对照组大鼠海马结构中,BDNF阳性细胞表达很强,细胞排列密集,着色深。实验组大鼠海马阳性细胞数量明显减少,且多数细胞呈空泡状,胞桨着色很浅。其中以齿状回和CA3区为甚。 3、海马中BDNF的表达 通过比较实验组和对照组BDNF表达的平均光密度和阳性面积比,可以看出,在海马各亚区CAI、CAZ、CA3、CA4和DG区正常组大鼠BDNF的光密度和阳性面积比均高于实验组。正常海马BDNF表达在齿状回和CA3区表达明显。经过应激后,实验组海马各亚区的BDNF表达均低于正常对照组(P<0.01),齿状回区最显著,CA3区改变次之。讨论 到目前为止,动物抑郁模型一般分为应激模型、孤养模型、药理学模型、脑损伤模型和操作行为模型等。建立理想的抑郁动物模型,不但可以研究抑郁症的症状学与体内某些化学物质异常改变之间的相关性,或检验治疗药物的效果和探索新药物的疗效,而且可以直接从脑组织中采集标本,直接检测抑郁症发病过程中某些生化物质的改变及神经生物学、形态学上的异常变化。本研究综合了应激和孤养两种经典模型,利用长期不可预见的中等强度应激,造成孤养动物的抑郁状态。 开场行为评定检测大鼠在新异环境中的启动活动、探究行为、紧张恐惧状态和对新环境的警觉性。急性应激时动物的行为活动增加,随着应激时程的延长,动物的行为活动逐渐减少,行为表现由兴奋、焦虑状态过渡到抑制、抑郁状态。本模型中动物经21天慢性综合性应激后中央格停留时间延长,水平穿越格数减少,直