随着生物技术的发展,越来越多具有特定药效的生物大分子,如多肽、蛋白质、核酸等可望成为治疗药物。与小分子药物(化合物)相比,生物大分子具有高分子量、高溶解度、低渗透性的特点,加之胃液中的低pH环境和胃肠道大量酶的存在,生物大分子口服给药的药效非常低,故生物大分子的给药方式以注射为主。结构修饰是一种常用的改善生物大分子口服给药药效的策略。本研究的主要目的是考察用特定的小分子对生物大分子进行修饰,能否提高生物大分子的口服药效。论文主要考察了两类小分子:一类是天然存在的脂质分子。脂质分子具有两亲性,会天然地被胃肠道系统吸收。本研究选取了胆固醇、胆酸甲酯和四种不同链长的脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸和月桂酸)为代表;另一类是二肽分子。作为寡肽转运蛋白1(PEPT1)的一种重要底物,它们能被肠道中的PEPT1识别和转运。根据实验室之前开展的相关工作:建立二肽序列库并通过体内外实验筛选出对PEPT1亲和性较好的二肽序列。本研究选取了苯丙氨酸-丙氨酸(Phe-Ala,AF)、脯氨酸-亮氨酸(Pro-Leu,LP)、精氨酸-异亮氨酸(Arg-Ile,IR)、缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys,KV)为代表。本研究主要考察两种生物大分子:寡聚核苷酸类药物CpG寡核苷酸(CpG ODN)和多肽类药物艾塞那肽(Exenatide)。含非甲基化CpG单元的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)是Toll样受体9(TLR9)的激动剂,能够激活机体的免疫系统,诱导并增强固有免疫和获得性免疫的应答。作为免疫佐剂,CpGODN在治疗感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤防治等领域有广泛的应用前景。本研究中选择CpG 1826序列为代表,它主要可以刺激提高B细胞IL-6和体内抗体的表达水平。艾塞那肽是人工合成的GLP-1(glucagon-like peptide-1)受体激动剂,由39个氨基酸组成,与天然的GLP-1相比,有类似的降低血糖作用但结构更稳定,因此常应用于2型糖尿病的治疗。本研究首先考察上述两类结构修饰能否提高CpGODN的口服药效。在第二章中,通过不同的反应路线实现对胆酸甲酯、胆固醇和不同链长的脂肪酸的叠氮化修饰,随后采用点击化学(Click Chemistry)中的 CuAAC(copper-catalyzed azide-alkynecycloaddition)反应连接叠氮修饰的脂质和炔基修饰的CpGODN,成功得到脂质修饰的CpGODN。在第三章中,对六种脂质以及另外四种二肽修饰的CpGODN进行体外活性和体内药效的评价和比较。CpG ODN与小鼠脾细胞共孵育并检测上清白介素-6(IL-6)表达水平,以此来评价修饰后CpGODN的体外活性。结果显示,除胆酸甲酯对CpGODN活性产生了较显著影响外,胆固醇、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸以及月桂酸的修饰仅略微影响了 CpGODN的体外活性,而四种二肽修饰对其活性几乎没有影响。随后,我们以卵清蛋白(OVA)作为模型抗原进行小鼠体内免疫实验,检测口服给药修饰与未修饰CpGODN后,小鼠血清特异性抗体表达水平,以考察修饰对CpGODN 口服药效的影响。结果显示,六种脂质修饰中,胆固醇、胆酸甲酯和肉豆蔻酸的修饰并不能明显提高CpGODN的口服药效;棕榈酸的修饰能一定程度提高CpGODN的口服药效但不显著;硬脂酸和月桂酸的修饰能显著提高CpG ODN的口服药效,其中月桂酸的作用相对更好一些。此外,我们还比较了硬脂酸修饰CpGODN与CpGODN经小鼠尾静脉注射后的药效。结果显示静脉注射给药后,硬脂酸修饰的CpGODN也显著地提高了小鼠抗体表达水平,这可能是硬脂酸修饰提高CpGODN 口服药效的原因之一。另外,我们以CT-26荷瘤小鼠为模型,以月桂酸修饰和未修饰的CpGODN作为口服单一药物,比较二者的抗肿瘤效果。虽然月桂酸修饰提高脾细胞的IL-6表达,但肿瘤生长并未受到抑制,该结果表明CpGODN以单一口服给药作为抗肿瘤药物仍有难度。四种多肽中,AF和LP的修饰能更好地提高CpGODN的口服药效。综上,我们筛选得到硬脂酸、月桂酸、AF和LP四种、两类可提高CpGODN 口服药效的小分子。以修饰后CpG ODN的实验为基础,我们考察小分子修饰能否提高Exenatide的口服药效。考虑到Exenatide本身是多肽类药物,二肽修饰可能能更好地保留其活性,另外二肽修饰可以在固相合成Exenatide时直接引入,避免后续分离纯化问题,因此优选AF、LP作为修饰分子,设计并得到二肽替换的Exenatide,HA-39和HL-39,并对它们的体外活性和体内药效进行评价。体外GLP-1受体激动剂活性检测实验表明,二肽替换在一定程度上降低了 Exenatide的活性,其中AF替换的Exenatide活性降低得更多。以高血糖小鼠为模型,肠溶胶囊形式给药,考察二肽替换对Exenatide 口服药效的影响。结果显示,HL-39的降血糖效果较好,明显优于Exenatide(p<0.05),而HA-39的降血糖效果与Exenatide类似,表明LP修饰可以提高Exenatide的口服药效。进一步,我们考察了剂量对HL-39 口服药效的影响。结果显示,高、中剂量组药效显著好于低剂量组,而高、中剂量组间略有差异但不显著,这可能是因为机体的自我调节作用不会使血糖无限制降低。HL-39与PEPT1已知底物甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)竞争实验结果显示,Gly-Sar的存在显著抑制了 HL-39的口服药效,间接证明PEPT1参与了 HL-39的肠道吸收和转运。大鼠在体单向肠灌流实验结果显示,HL-39相比于Exenatide具有显著提高的吸收速率常数Ka和有效透过系数Peff(P<0.05),表明LP替换确实提高肠道对Exenatide的吸收。综上,本研究对六种脂质和四种二肽修饰的CpGODN进行体内外活性评价,筛选得到硬脂酸、月桂酸两种脂质和AF、LP两种二肽,可以显著提高CpGODN的口服药效;从中选择AF与LP进一步对Exenatide进行修饰,实验结果显示LP修饰显著提高Exenatide的口服药效和肠道吸收。研究结果表明,脂质和二肽两类小分子修饰,可以提高寡聚核苷酸和多肽类药物的口服药效,这为以它们为代表的生物大分子的口服给药提供了一种新的选择。