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中度嗜盐菌（Moderately halophile）指的是在含有3-15%NaCl的条件下表现出最适生长的一个微生物类群。以往报道表明,很多中度嗜盐菌在具有高效耐盐能力的同时也具有高效耐碱能力。与一般非嗜盐菌相比,中度嗜盐菌中耐盐碱基因种类更多,其耐盐碱分子遗传机制也更加复杂。动性球菌（Planococcus sp.） NEAU-ST10-9是本实验分离自松嫩平原盐碱地中的一株中度适盐菌,该菌株能够耐受10%的NaCl并能在pH12的碱性条件下生长。本研究借助大肠杆菌（Escherichia coli）Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc（ΔnhaA, ΔnhaB, ΔchaA）,采用基因文库筛选法与基因功能互补法相结合的技术,从动性球菌（Planococcus sp.） NEAU-ST10-9中筛选到一个长2712bp的具有Na+/H+逆向转运蛋白功能的DNA片段。序列分析显示,该片段包含3个完整的开放读码框（ORF1-3）以及各自的SD序列和推测的启动子。其中,ORF1长600bp,含有200氨基酸残基,与东海动性球菌（Planococcus donghaensis） MPA1U2中的一个推测蛋白（hypothetical protein）同源性最高（49%）,其基因被命名为hyp；ORF2长531bp,含有177氨基酸残基,与嗜碱芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus） OF4中一个推测的TetR家族转录调控蛋白（TetR family transcriptional regulator）同源性最高（49%）,其基因被命名为tetR; ORF3长918bp,含有306个氨基酸残基,与还原硒酸盐芽胞杆菌（Bacillus selenitireducens） MLS10中一个推测的阳离子扩散促进子家族转运蛋白（cation diffusion facilitator family transporter）同源性最高（43%）,其基因被命名为cdffT。由于后者是在基因组测序的基础上通过同源比对分析推测的,因此,我们将ORF3与所有已鉴定的CDF家族成员进行同源性比对,包括枯草芽胞杆菌（B. subtilis）中的BsCzcD （Accesion.version No. AAB53029.1）、抗重金属富养罗尔斯通菌（Ralastonia metallidurans）中的RmCzcD （Accesion.version No. YP145596.1）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的ScCOT1（Accesion.version No. AAA74884.1）和ScZRC1（Accesion.version No. NP013970.1）、大肠杆菌（E. coli）中的EcZitB（Accesion.version No. AAC73839.1）)和EcFieF（Accesion.version No.NP418350.1）,发现ORF3与EcZitB、RmCzcD、ScZRC1、BsCzcD、ScCOT1以及EcFieF的同源性分别为17.2%、15.2%、14.3%、13.0%、12.9%和11.9%（图3-11）。既然ORF3与已鉴定的CDF家族成员的同源性非常低,那么CdffT应该是CDF家族中的一个新型蛋白。耐盐碱实验表明,cdffT基因能够提供大肠杆菌（E.coli）KNabc对0.4MNaCl、10mM LiCl以及碱性pH8.0的抗性,这暗示cdffT基因具有Na+/H+逆向转运蛋白功能。我们测试了cdffT基因对二价金属离子的抗性。结果显示,在0.2-1.0mM ZnCl2或0.2-0.3mM CdCl2存在的条件下,与负对照KNabc/pEASY T3相比,KNabc/pEASY T3-cdffT均表现出了显著或极显著的抗性；而在0.5-1.0mM CoCl2存在的条件下,与负对照KNabc/pEASY T3相比,KNabc/pEASY T3-cdffT表现出一定抗性,但不显著。此外,在1.0mM ZnCl2、0.75mM CoCl2或0.25mM CdCl2存在的条件下,我们进一步测定了KNabc/pEASY T3-cdffT和负对照KNabc/pEASY T3的二价金属离子耐受生长曲线。结果进一步证实CdffT具有显著的Zn2+和Cd2+抗性,但不具有显著的C02+抗性。为了鉴定cdffT基因的功能,我们测试了CdffT的阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性。结果显示,KNabc/pEASY T3-cdffT具有Na+（Li+, K+）/H+逆向转运蛋白活性,而负对照KNabc/pEASY T3不具有Na+（Li+, K+）/H+逆向转运蛋白活性,这表明cdffT基因具有Ng/H+逆向转运蛋白功能。此外,与负对照KNabc/pEASY T3相比,KNabc/pEASY T3-cdffT表现出更高的Zn2+（Cd2+）/H+逆向转运蛋白活性,这表明cdffT基因具有Zn2+（Cd2+）/H+逆向转运蛋白功能。需要指出的是,无论是KNabc/pEASY T3-cdffT还是负对照KNabc/pEASY T3,我们均无法检测到Co2+/H+逆向转运蛋白活性。我们进一步分析了pH值对CdffT的阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性的影响,结果显示,CdffT在pH6.5-9.5的范围内具有Na+（Li+, K+）/H+逆向转运蛋白活性,而CdffT在pH6.5-8.5的范围内具有Zn2+（Cd2+）/H+逆向转运蛋白活性。Na+（Li+, K+, Zn2+, Cd2+）/H+逆向转运蛋白活性的最适pH值分别为pH9.0、pH8.5、pH9.5、pH8.0和pH8.0,这表明CdffT的阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。底物亲和性分析结果显示,CdffT对Na+、Li+、K+、Zn2+和Cd2+的表观Km值分别为1.10、1.30、1-18、1.00和2.19,表明CdffT的底物亲和性为：Zn2+>Na+>K+>Li+>Cd2+。基于以上结果,我们认为CdffT应该是CDF家族的一个新型蛋白,它不仅具有转运二价金属离子的功能,而且还能转运单价阳离子,这个发现在CDF家族蛋白的研究中尚属首例。此外,我们证实CdffT是通过行使Na+（Li+, K+, Zn2+, Cd2+）/H+逆向转运蛋白活性的方式转运对应阳离子的。