研究背景：脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是脑卒中疾病中的最严重亚型,具有较高的发病率、致死率和致残率,世界范围内的发病率占到脑卒中总数的8%-30%,其30天的死亡率约为30%-55%,只有约20%的患者能够在6个月内恢复生活自理。脑出血后,血肿周围脑水肿的形成是患者致死、致残的主要原因,并且水肿的程度与患者预后密切相关。血管源性脑水肿是脑出血后脑水肿的主要类型。脑出血发生后,血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)破坏是血管源性脑水肿发生、发展的重要原因之一。BBB是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构,它的基本构成包括：脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接、内皮基膜、周细胞和胶质细胞终足。其中,内皮细胞及其间紧密连接是维持BBB功能的关键结构。紧密连接(Tight junction, TJ)位于相邻的两个内皮细胞之间,是由一组蛋白分子元件构成的复合体。构成紧密连接的蛋白分子包括：跨膜蛋白(occludins, claudins, junction associated molecules (JAM)等)和胞浆附属蛋白(zonula occludens (ZO))等。这些蛋白分子中,跨膜蛋白claudins是最重要的一种紧密连接蛋白,它是整个紧密连接的支柱结构,并决定了物质跨细胞转运的特异性和选择性。紧密连接蛋白一旦破坏,可直接引起血脑屏障的通透性增加,从而导致脑水肿的发生。脑出血发生后,红细胞裂解的重要产物血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是导致血脑屏障通透性增加和脑水肿发生的重要病理介质之一。血红蛋白由血红素和珠蛋白构成,是颅内血肿的主要成分。在脑出血的早期即有血红蛋白从血块中释放进入周围脑组织中,且血红蛋白的释放与血脑屏障通透性增加及脑水肿的发生密切相关。但是血红蛋白破坏血脑屏障的具体机制仍不清楚。Rho即Ras同源物,具有GTP酶活性,故又称Rho GTP酶(Rho guanosine triphosphatases,Rho GTPases),具有RhoA,RhoB,RhoC三种异构体.Rho激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase, ROCK)属于一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,是Rho最重要的下游效应分子,有两种基本亚型(ROCKl和ROCK2).Rho和Rho激酶均广泛存在于人体各种组织中的,而只有RhoA和ROCK2在脑中表达量较高。肌球蛋白轻链(yosin light chain,MLC)和肌球蛋白磷酸酶目标亚基(myosin phosphatase targeting subunit,MYPT))是ROCK的重要底物之一。ROCK活化后可使MLC发生磷酸化,成为磷酸化的肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain,p-MLC)。p-MLC增多可促使内皮细胞应力纤维(stress fiber)形成,从而引起细胞骨架重塑、细胞收缩等效应,导致内皮细胞间隙增大、紧密连接破坏、血管内皮细胞通透性增高等。基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidases,MMPs)是一组重要的细胞外基质降解酶,具有多种生物学功能,目前已知的亚型有20余种,其中,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与脑血管病的发生密切相关。凝血酶、血红蛋白、细胞因子、氧化应激、缺氧等因素均可导致基质金属蛋白酶-9表达增加。基质金属蛋白酶-9增加后可打破细胞外基质正常的代谢平衡,导致毛细血管基膜、内皮紧密连接结构的降解,进而引起血脑屏障通透性增加,诱发脑水肿。目的：本研究向大鼠尾状核内注入Hb,检测不同时间点注入点周围脑组织血脑屏障通透性、脑水含量变化,紧密连接蛋白claudin-5、p-MLC蛋白的表达、分布变化,hoA、ROCK2、MMP-9的表达、分布变化、ROCK活性变化及大鼠行为学变化,探究Hb对ROCK和MMP-9的激活和上调作用,并进一步分析ROCK和MMP-9在血脑屏障损伤中的作用机制。实验方法：1、实验分组及模型制作SPF级SD成年雄性大鼠,体质量为280±20g,随机分为正常组、Hb组和生理盐水组,后两组按照模型完成后观察时间分为6h、12h、24h共3个亚组。立体定向仪辅助下向大鼠右侧尾状核注射20μl血红蛋白溶液(150g/L),制成大鼠Hb脑内注入模型。生理盐水组大鼠在相同位置注射20μ1生理盐水。造模后6h随机选取Hb组大鼠5只,观察行为学变化后,取脑组织制备石蜡标本,进行HE染色,观察血肿位置,评估造模效果。2、血脑屏障通透性检测大鼠麻醉后,经股静脉注射2%伊文氏蓝溶液(4ml/kg),2h后行生理盐水心脏灌注断头取脑。取Hb周围脑组织,秤量其湿重后加入50%三氯乙酸2ml,37℃孵育72h。充分研磨后15000rpm离心20mm,取1ml上清液与3ml无水乙醇混合,多功能酶标仪(参数设定：Ex620nm、Em680nm)测定荧光强度。标准曲线法测定伊文氏蓝含量,测定结果用μg/g脑组织表示。3、脑组织水含量测定大鼠麻醉后断头取脑,取Hb注射点周围约5mm厚脑组织,去除大脑皮质,使用电子天平称其湿重。将脑组织放入烤箱中100℃烘烤24h后,再次电子天平称其干重。脑组织水含量(%)=[(湿重-干重)/湿重]×100%。4、实时荧光定量PCR大鼠在相应时间点麻醉后断头,取Hb周围脑组织约30mg,无酶EP管存放,迅速放入-80℃冰箱中备用。按照说明书分别使用RNA提取试剂盒提取总RNA、反转录试剂盒反转录合成cDNA。荧光定量PCR反应条件为95℃10min,(95℃15s,60℃1min)×40个循环。标准曲线的相对定量法检测RhoA、ROCK2、MMP-9的mRNA表达量。5.Western Blot方法检测蛋白表达变化大鼠麻醉后断头取脑,取下Hb周围脑组织约100mg,液氮中保存备用。组织标本经匀浆、裂解、离心(12000rpm,5℃,10min)后,蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白裂解液依次经过电泳、转膜、一抗及二抗孵育、显影及定影。凝胶成像系统扫描并分析RhoA、ROCK2、claudin-5、p-MLC、ML、p-MYPT1、 MYPT1和MMP-9蛋白表达变化及ROCK活性变化。ROCK活性通过半定量计算p-MYPT1与MYPT1含量的比值以及p-MLC与MLC含量的比值获得。ROCK活性(%)以(p-MYPT1/MYPT1)×100%和(p-MLC/MLC)×100%表示。6.脑组织石蜡切片制作及HE染色大鼠麻醉后,分别用生理盐水和4%多聚甲醛溶液经心脏灌注。取损伤侧脑组织,4%多聚甲醛溶液中浸泡24小时后,按照常规石蜡包埋方法制作成石蜡标本并切片,切片厚度为41μm。组织切片经脱蜡、水化,苏木素染色2.5min,伊红溶液染色2.5min,酒精分化后显微镜下观察、拍片、分析。7.免疫组化组织切片经脱蜡、水化,在柠檬酸缓冲液(0.01mol/L)中给予微波热修复30min。依次给予0.3%过氧化氢溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶标记链霉卵白素工作液封闭和孵育。滴加DAB染色液显色,中性树胶封片后在显微镜下观察、拍照、分析。8、免疫荧光石蜡切片脱蜡至水,Tris-EDTA缓冲液(PH=8.5)中给予微波热修复,血清封闭后滴加一抗,4℃孵育24h。PBS溶液洗涤后滴加相应荧光二抗,37℃孵育1h。荧光显微镜下观察、拍照、分析。9、统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x±SD)表示,组间比较采用ONE-WAY方差分析,多重比较用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1.HE染色判断Hb注入位置造模后6h时,Hb组随机选取的5只大鼠均表现出左侧肢体无力、轻瘫或者向左侧转圈等现象,提示注入Hb后大鼠出现了对侧肢体运动功能障碍；脑组织HE染色发现,5只大鼠脑内Hb注入部位均位于右侧尾状核及其周围区域。这表明大鼠颅内Hb注入模型制作成功,该模型制作方法可靠。2.Hb引起血脑屏障通透性增加生理盐水组大鼠脑组织伊文思蓝渗透量未见明显变化。Hb组伊文思蓝渗透量在造模后6h即开始增多,12h时达到最大,24h开始下降,Hb组在各时间点的伊文思蓝渗透量均明显高于生理盐水组和正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.注入Hb后脑组织水含量增加生理盐水组在各时间点的脑组织水含量均未见明显增加。Hb组脑组织水含量从6h开始逐渐升高,24h达到最大值,Hb组在各时间点脑组织水含量均明显高于正常对照组和生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.Hb引起RhoA、ROCK2表达增多及claudin-5表达减少Western blot结果显示,生理盐水组的claudin-5蛋白表达较高。与生理盐水组相比,Hb注入点周围脑组织中的claudin-5蛋白表达降低,12h时降至最低,差别有统计学意义(p<0.05),并且在24h开始恢复。与claudin-5蛋白表达不同,正常对照组和生理盐水组RhoA、ROCK2的mRNA表达均较低。与正常对照组及生理盐水组相比,注入Hb后12h内的RhoA mRNA和ROCK2mRNA表达均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),且两者均在12h时达到最大值。RhoA、ROCK2的蛋白表达变化也呈现相同的趋势。5.Hb上调MMP-9表达Western blot结果显示,生理盐水组MMP-9表达较低。与生理盐水组相比,注入Hb后6h至12h, MMP-9蛋白表达均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),注入Hb后24h,MMP-9蛋白含量开始下降。MMP-9的mRNA表达呈现出类似的趋势：与生理盐水组和正常组相比,Hb注入点周围脑组织中MMP-9的mRNA表达在各时间点均明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Hb注入后12h,MMP-9mRNA表达量升高至最大值,达到正常组的7倍。6.Hb引起ROCK活性增加生理盐水组ROCK活性水平较低。与生理盐水组相比,注入Hb后6h至12h,随着p-MYPT1与MYPT1含量的比值以及p-MLC与MLC含量的比值逐渐增多,ROCK活性逐渐增加。与生理盐水组相比,Hb组在12h出现显著的统计学差异(P<0.05)。至24h,Hb组ROCK活性已经恢复至接近生理盐水组的水平,与生理盐水组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。7.免疫组化分析RhoA、ROCK2、p-MLC分布及表达变化。免疫组化DAB染色显示生理盐水组的RhoA、ROCK2、p-MLC均只有少量表达。Hb组三者表达均明显增多,且均在12h染色最深,即注入Hb后12h三者表达量达到最大值。RhoA大量分布在神经元及胶质细胞中,血管内皮细胞周围也有少量表达；ROCK2主要分布于胶质细胞和血管内皮细胞；p-MLC分布较集中且着色较深,主要分布于血管壁的内皮细胞,在其他细胞中表达量极少,其提示Hb可明显引起p-MLC在脑血管内皮细胞中的高表达。8.免疫组化分析MMP-9分布及表达变化。免疫组化DAB染色显示MMP-9在生理盐水组只有轻度淡染,Hb组MMP-9表达明显增多,主要分布于微血管壁内皮细胞和胶质细胞中,细胞外也可发现MMP-9的表达。9.免疫荧光分析p-MLC及紧密连接蛋白claudin-5分布及表达变化。免疫荧光双染显示生理盐水组claudin-5在脑血管壁荧光强度较高且连续表达。注入Hb后12h时claudin-5荧光强度明显减弱且在血管壁上表达的连续性下降。荧光密度值半定量分析表明,与生理盐水组相比,Hb组12h时的claudin-5表达明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。与claudin-5表达相反,生理盐水组的p-MLC在血管壁仅有微弱表达；注入Hb后12h时,血管壁的p-MLC表达增强,荧光密度值半定量分析显示,与生理盐水组相比,Hb组12h时p-MLC表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。10.Hb注入后大鼠行为学变化大鼠NSS评分表明,与正常对照组和生理盐水组比较,注入Hb后12h至7d,大鼠神经功能障碍明显增加,差别有统计学意义(p<0.05)。与其他时间点的各组比较,注入Hb后24h,大鼠神经功能障碍显著增加并达到最大值,差别有统计学意义(p<0.05)。至Hb注入后10d,大鼠NSS评分恢复正常,与正常对照组和生理盐水组比较,差别无统计学意义(p>0.05)。结论：1.Hb可引起脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5表达、分布变化,进而导致血脑屏障的破坏和脑水肿的形成。2.Hb可引起脑实质内Rho激酶的激活,使毛细血管壁上MLC发生磷酸化反应,导致紧密连接结构受损,从而诱发血脑屏障的破坏和脑水肿的形成。3.Hb可上调MMP-9的表达,增多的MMP-9通过降解紧密连接蛋白,进一步加重血脑屏障的破坏。