miRNAs(microRNAs)是一类内源性、非编码蛋白的单链小分子RNA。其大小约为20~25nt,编码基因约占整个基因组的1%。miRNA参与基因的转录后调节,对基因表达具有重要调控作用。研究表明miRNA在各种真核细胞中广泛存在,参与生物体的生长发育、信号转导、组织分化、疾病发生等过程,还决定其它很多生物体发育和行为的变化。同时, miRNA在多种肿瘤的发生、发展中也扮演着相当重要的角色。miR-34a最早在C. elegans(Caenorhabditis elegan,秀丽隐杆线虫)中被发现,是一个进化保守miRNA家族miR-34s中的一员。Welch等最早将miR-34a与肿瘤发生发展联系起来。他们发现miR-34a的编码基因位于染色体1p36,并常在人神经母细胞瘤中缺失。miR-34a受经典抑癌基因p53的直接调控,在miR-34a上游约30kb区域部位有p53高度保守的结合位点。miR-34a通过下调CDK4、CDK6、E2F3、E2F5、c-Met等癌基因发挥其肿瘤抑制作用。在p53引起细胞周期的G1期阻滞、细胞衰老、凋亡等生物学行为中,miR-34a同样扮演着重要的角色。miR-34a的失活或缺失可能与多种肿瘤的发病机理有关,但目前miR-34a在骨肉瘤中的功能鲜有报道。因此,研究miR-34a在骨肉瘤中的功能、作用机制并进一步探索其临床应用具有重要意义。在前期的研究中,我们通过microRNA基因芯片技术对不同转移能力骨肉瘤细胞系(E10、H9)中差异表达的miRNA进行分析发现,miR-34a在E10细胞中的表达下调,所以本实验将在此基础上对miR-34a与骨肉瘤之间的关系进行更进一步的研究。研究目的:验证在不同转移能力骨肉瘤细胞系(E10、H9)中miR-34a的差异表达;研究miR-34a的在骨肉瘤SOSP-9607细胞中的生物学功能并进一步研究其作用机制,为miR-34a在骨肉瘤预后判断和治疗等方面的临床应用提供理论基础。研究方法:1.采用Realtime RT-PCR和Northern blotting分析的方法,对前期用miRNA基因芯片筛选出来的在不同转移能力骨肉瘤细胞系(E10、H9)中差异表达的miR-34a基因进行验证。2.构建人miR-34a的真核表达载体,用其转染SOSP-9607细胞,并用G418筛选miR-34a稳定表达细胞系,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定实验基础。3.用pcDNA-miR34a或pcDNA3.1(+)转染骨肉瘤SOSP-9607细胞,观察其在骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖,侵袭和迁移等方面的作用。构建裸鼠的骨肉瘤原位成瘤肺转移模型,并进一步研究miR-34a对骨肉瘤细胞原位成瘤能力和肺转移能力的影响。4.通过miRanda,TargetScan和PicTar等生物信息学计算方法,分析miR-34a可能的靶基因,并结合靶基因的功能最终确定待验证的靶基因。研究结果:1.分别用Northern blotting和Realtime RT-PCR的方法对miR-34a在E10、H9细胞中的表达进行验证,结果显示miR-34a在E10中的表达明显降低,与芯片检测的结果一致。2.成功构建了人miR-34a的真核表达载体pcDNA-miR34a。pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSP-9607细胞中上调miR-34a的表达。获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系。3.在体外,外源性miR-34a对SOSP-9607细胞的增殖,侵袭和迁移能力有明显的抑制作用。动物实验中,miR-34a对骨肉瘤的原位成瘤能力和肺转移能力同样有显著的抑制作用。4.通过miRanda、TargetScan和PicTar等生物信息学计算方法,分析miR-34a可能的靶基因,并结合靶基因的功能最终选出了几个待验证的miR-34a功能相关靶基因。分别为:c-Met、Bcl2、Notch -1和Notch-2。结论:1. miR-34a在不同转移能力骨肉瘤细胞系中差异表达,与骨肉瘤转移具有相关性。有必要对miR-34a在骨肉瘤转移中的功能及基因调控机制作进一步的深入研究。2.成功构建了人miR-34a的真核表达载体pcDNA-miR34a,并在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。3. miR-34a具有显著的抑癌生物活性,将有可能成为骨肉瘤治疗的新靶点。4.通过生物信息学方法,初步确定了与miR-34a功能有可能相关的靶基因,为进一步验证miR-34a的靶基因指明了方向、奠定了基础。