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背景:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是全球范围内与癌症相关死亡的主要原因，目前，随着分子靶向药物和免疫抑制剂的引入，NSCLC的治疗策略发生了巨大的变化，但总体疗效仍未令人满意。ErbB家族成员经常在多种癌症中过度表达、扩增或突变，使其成为恶性肿瘤重要的治疗靶点。迄今为止，大多数关于ErbB受体在癌症发病机制中的作用的研究都集中在EGFR或ErbB2上，药物开发与此平行。ErbB3的功能及其在人类疾病中的作用研究较少，目前已有研究发现ErbB3是促进肿瘤发生和发展的影响因子，被认为是癌症治疗的潜在靶点。Ebp1是ErbB3的主要结合蛋白，是小鼠蛋白P2AG4的人类同源蛋白，受细胞周期调控，有报道证实Ebp1在人类大脑胶质瘤中高表达，导致p53蛋白表达下调，促进体外和体内肿瘤细胞的增殖，导致临床治疗效果差，也有报道称在乳腺癌中Ebp1的高表达与患者的临床分期、病理分级及不良预后密切相关。Ebp1可否调节ErbB3的致癌活性或在促进癌症进程中具有ErbB3的独立活性仍有待充分阐明。截至目前，Ebp1在NSCLC中的表达、生物学功能及分子机制尚不清楚，因此探究Ebp1在NSCLC中的作用及机制对于探寻NSCLC治疗的新分子靶点、改善NSCLC患者的预后具有十分重要的意义。
目的:分析Ebp1在NSCLC组织中的表达水平及其与患者临床病理学参数和生存期的相关性，通过体内外实验探究Ebp1差异表达在NSCLC细胞增殖、侵袭与转移过程中的作用及可能的分子机制，阐明Ebp1在NSCLC患者的早期诊断及预后成为新分子标志物的可能性。
方法:
1.数据库及NSCLC组织芯片的分析:
(1)通过TCGA、Oncomine数据库检索Ebp1mRNA在NSCLC组织及其正常肺组织中的表达以及其与患者生存期之间的关系;
(2)通过免疫组织化学染色方法检测Ebp1蛋白在NSCLC组织及癌旁组织中的表达情况;
(3)比较NSCLC组织与癌旁组织中Ebp1蛋白的表达水平并分析Ebp1蛋白的表达与患者临床病理学参数及Ki-67的相关性;
(4)采用Kaplan-Meier生存曲线分析Ebp1蛋白的表达在NSCLC患者中临床预后评估中的意义。
2.体外实验:
(1)应用Westernblotting方法检测Ebp1蛋白在支气管上皮细胞株(16HBE)及NSCLC细胞株(A549、H522、PC9、H650)中的表达情况，并筛选出Ebp1表达量相对较高的A549及PC9细胞进行后续的实验;
(2)利用短发夹(shRNA )技术沉默A549及PC9细胞中的Ebp1基因，Westernblotting实验检测了NSCLC细胞中Ebp1蛋白的表达;
(3)免疫荧光实验检测了Ebp1在A549及PC9细胞中的定位以及其沉默效果;
(4)CCK-8实验、平板细胞克隆实验及软琼脂克隆实验检测了差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞增殖能力的影响;
(5)流式细胞技术检测差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞周期的影响;
(6)划痕愈合实验、Transwell实验检测差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞的迁移、侵袭能力的影响;
(7)Westernblotting实验检测沉默Ebp1基因对A549及PC9细胞EMT相关标记物蛋白表达的影响;
(8)免疫荧光实验方法检测沉默Ebp1后A549及PC9细胞中EMT相关标志物Vimentin及N-cadherin的表达及定位。
3.体内实验:
(1)通过短发夹RNA技术将转染空载体的肺腺癌PC9细胞以及经过慢病毒介导的沉默Ebp1基因的肺腺癌PC9细胞分别接种于每只裸鼠的右侧肩部皮下，成功建立肺腺癌PC9细胞裸鼠植瘤模型;
(2)测量沉默Ebp1基因后对NSCLC裸鼠移植瘤体积生长变化的影响;处死裸鼠后，剥离肿瘤组织并计算移植瘤的体积;
(3)通过免疫组织化学染色实验检测沉默Ebp1基因的NSCLC裸鼠移植瘤组织中Ebp1、Ki-67和细胞周期蛋白CyclinD1以及EMT相关标记物MMP-2、slug、snail蛋白的表达情况;
结果:
1.数据库及NSCLC组织芯片分析:
(1)TCGA、Oncomine数据库显示Ebp1mRNA在NSCLC组织中的表达水平明显高于正常的肺组织，且Ebp1mRNA的高表达与NSCLC患者的不良预后有关;
(2)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中的表达水平明显高于癌旁组织(*P＜0.05);
(3)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中与肿瘤病理分级、临床分期及有无淋巴结转移显著相关(*P＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤生长的部位及大小无相关性(P＞0.05);
(4)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中与Ki-67增殖指数的表达呈正相关性(*P＜0.05);
(5)Kaplan-Meier生存分析显示，Ebp1蛋白高表达的患者的总生存期较Ebp1无表达患者明显缩短，呈负相关(**P＜0.01)。
2.体外实验
(1)Westernblotting结果表明，沉默Ebp1基因抑制了NSCLC细胞中Ebp1蛋白的表达(***P＜0.001);
(2)免疫荧光结果表明，Ebp1蛋白定位于细胞质和细胞核，主要在细胞质中表达;
(3)CCK-8实验、平板细胞克隆实验及软琼脂克隆实验结果表明，与对照组相比沉默Ebp1的A549及PC9细胞的增殖能力明显降低(***P＜0.001);
(4)细胞周期实验结果表明，Ebp1蛋白低表达之后，A549及PC9细胞发生细胞周期阻滞，细胞阻滞在G0/G1期，抑制NSCLC细胞的增殖;
(5)划痕实验和Transwell实验结果表明，沉默Ebp1基因能够使A549及PC9细胞的迁移与侵袭能力明显下降(***P＜0.001);
(6)Westernblotting实验结果表明，沉默Ebp1基因能上调A549及PC9细胞中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白的表达(**P＜0.01)，下调间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug及基质金属蛋白酶MMP-2的表达(***P＜0.001);
(7)免疫荧光实验结果表明，A549及PC9细胞中Vimentin及N-cadherin均定位于细胞质，沉默Ebp1基因后Vimentin及N-cadherin蛋白表达量明显下降(***P＜0.001);
3.体内实验:
(1)成功建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型，实验结果表明，沉默Ebp1基因后，NSCLC裸鼠移植瘤体积明显缩小(**P＜0.01);
(2)免疫组织化学染色结果表明，沉默Ebp1基因后，NSCLC裸鼠移植瘤组织中Ebp1、Ki-67、细胞周期蛋白CyclinD1的表达明显下降(***P＜0.001);间质细胞标记物Slug、Snail表达水平明显下降(***P＜0.001)，基质金属蛋白酶MMP-2的表达有所下降(**P＜0.01)。
结论:
1.Ebp1蛋白在NSCLC组织中的表达水平明显升高，可在一定程度上预示NSCLC患者的不良预后。
2.Ebp1具有促进NSCLC细胞增殖、侵袭与转移的能力。
3.Ebp1通过调控EMT进程参与NSCLC细胞的侵袭、转移。
目的:分析Ebp1在NSCLC组织中的表达水平及其与患者临床病理学参数和生存期的相关性，通过体内外实验探究Ebp1差异表达在NSCLC细胞增殖、侵袭与转移过程中的作用及可能的分子机制，阐明Ebp1在NSCLC患者的早期诊断及预后成为新分子标志物的可能性。
方法:
1.数据库及NSCLC组织芯片的分析:
(1)通过TCGA、Oncomine数据库检索Ebp1mRNA在NSCLC组织及其正常肺组织中的表达以及其与患者生存期之间的关系;
(2)通过免疫组织化学染色方法检测Ebp1蛋白在NSCLC组织及癌旁组织中的表达情况;
(3)比较NSCLC组织与癌旁组织中Ebp1蛋白的表达水平并分析Ebp1蛋白的表达与患者临床病理学参数及Ki-67的相关性;
(4)采用Kaplan-Meier生存曲线分析Ebp1蛋白的表达在NSCLC患者中临床预后评估中的意义。
2.体外实验:
(1)应用Westernblotting方法检测Ebp1蛋白在支气管上皮细胞株(16HBE)及NSCLC细胞株(A549、H522、PC9、H650)中的表达情况，并筛选出Ebp1表达量相对较高的A549及PC9细胞进行后续的实验;
(2)利用短发夹(shRNA )技术沉默A549及PC9细胞中的Ebp1基因，Westernblotting实验检测了NSCLC细胞中Ebp1蛋白的表达;
(3)免疫荧光实验检测了Ebp1在A549及PC9细胞中的定位以及其沉默效果;
(4)CCK-8实验、平板细胞克隆实验及软琼脂克隆实验检测了差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞增殖能力的影响;
(5)流式细胞技术检测差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞周期的影响;
(6)划痕愈合实验、Transwell实验检测差异表达的Ebp1对A549及PC9细胞的迁移、侵袭能力的影响;
(7)Westernblotting实验检测沉默Ebp1基因对A549及PC9细胞EMT相关标记物蛋白表达的影响;
(8)免疫荧光实验方法检测沉默Ebp1后A549及PC9细胞中EMT相关标志物Vimentin及N-cadherin的表达及定位。
3.体内实验:
(1)通过短发夹RNA技术将转染空载体的肺腺癌PC9细胞以及经过慢病毒介导的沉默Ebp1基因的肺腺癌PC9细胞分别接种于每只裸鼠的右侧肩部皮下，成功建立肺腺癌PC9细胞裸鼠植瘤模型;
(2)测量沉默Ebp1基因后对NSCLC裸鼠移植瘤体积生长变化的影响;处死裸鼠后，剥离肿瘤组织并计算移植瘤的体积;
(3)通过免疫组织化学染色实验检测沉默Ebp1基因的NSCLC裸鼠移植瘤组织中Ebp1、Ki-67和细胞周期蛋白CyclinD1以及EMT相关标记物MMP-2、slug、snail蛋白的表达情况;
结果:
1.数据库及NSCLC组织芯片分析:
(1)TCGA、Oncomine数据库显示Ebp1mRNA在NSCLC组织中的表达水平明显高于正常的肺组织，且Ebp1mRNA的高表达与NSCLC患者的不良预后有关;
(2)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中的表达水平明显高于癌旁组织(*P＜0.05);
(3)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中与肿瘤病理分级、临床分期及有无淋巴结转移显著相关(*P＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤生长的部位及大小无相关性(P＞0.05);
(4)Ebp1蛋白在NSCLC组织芯片中与Ki-67增殖指数的表达呈正相关性(*P＜0.05);
(5)Kaplan-Meier生存分析显示，Ebp1蛋白高表达的患者的总生存期较Ebp1无表达患者明显缩短，呈负相关(**P＜0.01)。
2.体外实验
(1)Westernblotting结果表明，沉默Ebp1基因抑制了NSCLC细胞中Ebp1蛋白的表达(***P＜0.001);
(2)免疫荧光结果表明，Ebp1蛋白定位于细胞质和细胞核，主要在细胞质中表达;
(3)CCK-8实验、平板细胞克隆实验及软琼脂克隆实验结果表明，与对照组相比沉默Ebp1的A549及PC9细胞的增殖能力明显降低(***P＜0.001);
(4)细胞周期实验结果表明，Ebp1蛋白低表达之后，A549及PC9细胞发生细胞周期阻滞，细胞阻滞在G0/G1期，抑制NSCLC细胞的增殖;
(5)划痕实验和Transwell实验结果表明，沉默Ebp1基因能够使A549及PC9细胞的迁移与侵袭能力明显下降(***P＜0.001);
(6)Westernblotting实验结果表明，沉默Ebp1基因能上调A549及PC9细胞中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白的表达(**P＜0.01)，下调间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug及基质金属蛋白酶MMP-2的表达(***P＜0.001);
(7)免疫荧光实验结果表明，A549及PC9细胞中Vimentin及N-cadherin均定位于细胞质，沉默Ebp1基因后Vimentin及N-cadherin蛋白表达量明显下降(***P＜0.001);
3.体内实验:
(1)成功建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型，实验结果表明，沉默Ebp1基因后，NSCLC裸鼠移植瘤体积明显缩小(**P＜0.01);
(2)免疫组织化学染色结果表明，沉默Ebp1基因后，NSCLC裸鼠移植瘤组织中Ebp1、Ki-67、细胞周期蛋白CyclinD1的表达明显下降(***P＜0.001);间质细胞标记物Slug、Snail表达水平明显下降(***P＜0.001)，基质金属蛋白酶MMP-2的表达有所下降(**P＜0.01)。
结论:
1.Ebp1蛋白在NSCLC组织中的表达水平明显升高，可在一定程度上预示NSCLC患者的不良预后。
2.Ebp1具有促进NSCLC细胞增殖、侵袭与转移的能力。
3.Ebp1通过调控EMT进程参与NSCLC细胞的侵袭、转移。