研究背景和目的大肠癌(colorectal cancer, CRC)是消化道的常见恶性肿瘤。在我国,CRC发病率继肺癌和胃癌之后,居第三位。CRC早期常无明显症状,临床上确诊的CRC多为中晚期。因此,提高CRC生存率的关键是要加强早期CRC的筛查。目前常用于大肠肿瘤筛查的检查有：结肠镜、粪便潜血试验(FOBT)、粪便DNA检测等等。结肠镜是侵入性检查,人们接受性差,而且具有一定风险,费用也较高,因此,很难进行大规模的筛查。国内外目前开展大规模CRC筛查的方法是FOBT,它具有简便、安全、廉价、耐受性好、无创等优点,但它敏感性和特异性欠佳,检测CRC的敏感性和特异性仅为37.1%-79.4%和86.7%-97.7%。绝大多数CRC起源于腺瘤,尤其是直径超过1cm、组织学证实是绒毛状或重度不典型增生的进展期腺瘤(advanced adenomas. AA),对其进行检测并及时切除可以同时降低CRC的发生率和死亡率,因此,AA是我们筛查的主要目标。FOBT对腺瘤检出率低,而粪便DNA检测对腺瘤的检出率较高,两者单独检测AA的敏感性分别是18%和10%(P<0.05),特异性相当分别是94%和95%。除廉价外,粪便DNA检测几乎继承了粪便潜血所有的优点,而且检测CRC的敏感性和特异性分别可达52%-91%和91%-97%。调查还发现,与肠镜和FOBT等其它CRC筛查方法相比,人们更多地选择粪便DNA检测作为常规筛查。但是,目前粪便DNA检测的成本效益还不如粪便潜血。要使其成为在大规模人群中筛查CRC的常规检查,除了提高检测性能外,更重要的是降低检测成本,因此,急需寻找一种经济高效的粪便DNA检测方法。高分辨率熔解曲线分析(High-resolution melting, HRM)是一种新的分子检测技术,广泛应用于基因突变、基因甲基化水平检测及基因分型检测和HLA配型等领域,具有低成本、高通量、无污染、快捷、操作简便、敏感性和特异性好等特点,有效地弥补了传统粪便DNA检测费用高、操作复杂、过于专业化等缺点。我们课题组前期研究已经证实HRM检测大肠肿瘤患者粪便DNA突变具有很好的性能并且是稳定可靠的。已有人用甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析(Methylation-sensitive high-resolution melting, MS-HRM)检测血液和组织样本中DNA的甲基化并证实具有很好的性能。与血液、组织样本不同的是,粪便中人DNA含量极低,大约只占总粪便DNA的0.01%,而且粪便中的人DNA还包括了大量来自正常大肠粘膜的DNA。因此,从粪便样本中检测人基因的甲基化情况对检测技术的要求更高。目前,国内外尚无用MS-HRM技术检测粪便中基因甲基化来筛查大肠癌的研究报道。在本研究中,我们评估了应用MS-HRM技术检测粪便样本中SFRP2和VIM甲基化情况对大肠肿瘤进行筛查的可行性。方法1.研究对象2011.12～2013.03期间,在南方医院接受肠镜检查和／或普外科住院的CRC和AA术前患者作为病例组及肠镜检查阴性且病理未发现异常的正常人作为对照组(Normal controls, NC)。肠镜检查及术前收集患者的粪便标本,术后收集其病灶及邻近正常新鲜组织标本。并按最后的病理组织检查结果分为病例组和对照组。用于MS-HRM、MSP和BSP试验的SFRP2和VIM引物序列、扩增子长度、退火温度和扩增区域等见附表1。2.标本的收集(1)粪便：对确诊为CRC或AA的患者,在其手术(内镜下切除或外科手术)的肠道准备前收集3次大便标本(总量≥30g),把患者大便标本收集于干净无菌的容器里,置于冰上,并在24h内转移到-80℃冰箱保存。对匹配的肠镜阴性对照组,在其肠镜检查前或5天后按上述收集3次大便标本。(2)组织：肠镜下多块(≥6块)活检的或肠镜下全切或手术切下的CRC或AA病灶及邻近正常组织,无菌生理盐水冲洗2次后,切成0.5cm×0.5cm,厚度<0.5cm,重量≥2g的小块,立即置于冰上的无菌容器里,2小时内放入-80℃冰箱保存。3.DNA的提取按QIAamp DNA Mini Kit和QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的说明书分别提取组织和粪便样本DNA。用凝胶电泳测定提取DNA的质量,分光光度计测量提取DNA的浓度和纯度,要求：DNA样本浓度≥50μg/ml,260/280nm的吸光度位于1.7-1.9。达标的DNA样本均稀释到50ng/μL的终浓度,置入-20℃冰箱保存待用。4.亚硫酸氢盐处理按EZ DNA methylation-Gold KitTM说明书对提取的DNA及标准品DNA(CpGenome Universal Methylated DNA和Unmethylated DNA (Chemicon, Millipore Billerica, MA, USA))进行亚硫酸氢盐修饰。5. MS-HRM检测按EpiTect HRM PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的说明书在LightCycler(?) LC480System(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)仪器上对目标DNA进行扩增和HRM分析;A.25μl反应体系：2x EpiTect HRM PCR Master Mix12.5μl10μM (each) primer mix1.9μl RNase-free water2.0μl Template DNA8.6μlB.反应条件：C.HRM分析模式：Melting curve65℃1s95℃Continuous fluorescence data acquisition. Ramp rate:0.02℃/s25acquisitions per secondD. Cooling40℃1s6. MS-HRM的线性检测将甲基化DNA标准品,分别配成100%、75%、50%、25%、5%、1%和0甲基化的DNA样本,每种比例一式三份,每份包含100ng的模板DNA。亚硫酸氢盐处理后采用复孔对其进行MS-HRM检测。然后,以0%甲基化DNA作为参照标准,计算各检测样本的荧光差异值。这样对每种稀释比例的甲基化DNA,我们可以得到6个荧光差异值。最后我们对其进行线性回归检测。7. MS-HRM的重复性检测分别挑取SFRP2和VIM具有不同甲基化水平的三个样本,并分别编号为S1、S2、S3和V1、V2、V3。Intra-assay:以SFRP2为例,我们将三个样本都分成一式四份,然后对每个样本的四小份分别在不同时间进行亚硫酸氢盐修饰。这样,理论上我们可以获得四份具有相同甲基化水平的DNA样本,编号为B1-4。接着,对亚硫酸氢盐处理后的四小份样本同时进行MS-HRM检测。然后,计算各例样本中B1-4的荧光差异值以及三例样本荧光差异值的变异系数(coefficient of variation,CV)。它们主要反映的是亚硫酸氢盐修饰的变异程度。Inter-assay:以SFRP2为例,我们对三例样本同时进行亚硫酸氢盐修饰,然后将每例样本分成一式四份,编号为M1-4,再在不同时间对它们重复进行MS-HRM检测。然后计算各例样本中M1-4的荧光差异值以及三例样本荧光差异值的CV,这主要反映MS-HRM检测的变异程度。8.MSP检测采用盲法,按EpiTect MSP Kit (Qiagen, Hilden, Germany)说明书对样本DNA进行甲基化检测；A.50μl反应体系：EpiTect Master Mix,2x25μlPrimer A2μlPrimer B2μlTemplate DNA2μlRNase-free water19μlB.反应条件：C.电泳分析：取5μl PCR产物,在2.0%的琼脂糖凝胶中,通过溴化乙锭着色,用凝胶成像系统(Tanon, Shanghai, China)分析结果。9.BSP检测A.50μl反应体系：5U/μ1Taq DNA pol0.8μl10×PCR Buffer(with Mg2+)5μl10μM Forward Primer1μl10μM Reverse Primer1μ1Template3μlddH2O38.2μlB.反应条件：C.PCR电泳与回收：取5μl PCR产物,在3.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳；然后,按PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK8141)说明书对PCR产物进行纯化回收；D.PCR纯化产物连接到pUC18-T载连接反应体系：1μl10×Ligation Buffer1μl50%PEG50ng pUCm-T Vector0.2pmol PCR Productxμl H202.5U T4DNA LigaseFinal Volume10μl18℃连接过夜。E.连接产物转化按感受态细胞制备试剂盒(生工SK9307)说明书制备感受态细胞,对连接产物进行转化。F.蓝白斑筛选选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落,用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基,37℃培养过夜。目的片段TA克隆的菌落PCR鉴定(3%糖凝胶电泳检测)。G质粒提取按质粒抽提试剂盒(生工SK8161)提取质粒。H.质粒测序将提取的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司在ABI3730DNA测序仪(美国Biosystems公司)中测序。10. FOBT采用便隐血胶体金检测试纸(Fecal Occult Blood Gold Gel Stripe)(万华曼生物工程有限公司,北京)对粪便样本进行潜血检测。11.统计分析以α=0.05为检验水准。各组间年龄进行成组t检验；基因频率采用直接计数法。计数资料的比较,两样本间比较均运用χ2检验；四格表资料则均采用Fisher确切概率法,若为配对资料则采用McNemar检验,其符合率采用Kappa分析。统计分析均使用SPSS13.0软件包。结果样本的基本情况最终第二部分纳入37例CRC患者、26例AA患者,第三部分纳入40例CRC患者、36例AA患者和性别年龄与病例组相匹配的57例NC者,所有参与者均是中国人。第二部分CRC和AA组的平均年龄分别为65岁(43-80岁)和67.5岁(40-82岁)；第三部分CRC、AA和NC组的平均年龄分别为58岁(41-84岁)、58岁(40-72岁)和59岁(43-75岁),其中病例组和对照组年龄无统计学差异(P>0.05)。第二部分CRC和AA组的男女性别比例分别为21/16和11/15；第三部分CRC、AA和NC组的男女性别比例分别为26/14、19/17和34/23,其中病例组和对照组的性别无统计学差异(P>0.05)。第一部分MS-HRM和MSP检测DNA甲基化的灵敏度分析MS-HRM检测SFRP2和VIM基因甲基化的最低稀释浓度限度均为1%,而MSP均为5%。MS-HRM检测SFRP2和VIM基因甲基化范围均<1%的C5、C10和C14三个样本经MSP检测均为阴性；MS-HRM检测SFRP2基因甲基化范围为1-5%的C26、C34和C36以及VIM基因甲基化范围为1-5%的C25、C26和A10六个样本经MSP检测也都为阴性；而MS-HRM检测两靶基因甲基化范围均>5%的C3、C8、和C31三个样本经MSP检测均为阳性。第二部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化来筛查大肠肿瘤患者的可行性分析只要SFRP2和VIM两个目的基因中有一个甲基化阳性,我们便认为该样本为甲基化阳性。在肿瘤组织DNA样本中,BSP共检测出58例患者甲基化阳性,其中CRC患者34例,AA患者24例,甲基化检出率为92.1%(58/63)；在癌旁组织DNA样本中,BSP共检测出2例患者甲基化阳性,其中CRC患者2例,AA患者0例,甲基化检出率为3.2%(2/63)；肿瘤组织和邻近癌旁组织的甲基化检出率存在着显著差异(P<0.001)。在粪便DNA样本中,MS-HRM共检测出55例患者甲基化阳性,其中CRC患者33例,AA患者22例,甲基化检出率为87.3%(55/63)；MS-HRM的检测结果均被BSP检测所证实,MS-HRM的敏感度与特异度均为100%。粪便DNA与相应肿瘤组织甲基化检出率的符合率高度一致,Kappa值为0.744(在CRC、AA亚组中分别为0.843、0.629)。第三部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化筛查大肠肿瘤患者的性能评价MS-HRM检测出病例组71例患者甲基化阳性,其中CRC患者37例,AA患者34例,甲基化检出率为93.4%(71/76)；检测出对照组5例甲基化阳性,甲基化检出率为8.8%(5/57)；病例组和对照组间甲基化检出率有显著差异(P<0.001),而CRC与AA亚组间甲基化检出率无明显差异(P>0.05)。MSP检测出病例组63例患者甲基化阳性,其中CRC患者33例,AA患者30例,甲基化检出率为82.9%(63/76)；检测出对照组15例甲基化阳性,甲基化检出率为26.3%(15/57)：病例组和对照组间甲基化检出率有显著差异(P<0.001),而CRC与AA亚组间甲基化检出率无明显差异(P>0.05)。 FOBT检测出病例组43例患者甲基化阳性,其中CRC患者27例,AA患者16例,甲基化检出率为56.6%(43/76)；检测出对照组6例甲基化阳性,甲基化检出率为10.5%(6/57)；病例组和对照组间甲基化检出率有显著差异(P<0.001),而CRC与AA亚组间甲基化检出率无明显差异(P>0.05)。 MS-HRM和MSP检测粪便DNA甲基化的结果吻合度较弱,Kappa值在病例组中为0.386(在CRC和AA亚组中分别为0.553、0.182(P>0.05)),在对照组中为0.424。MS-HRM的诊断敏感性(93.4%,71/76)和特异性(91.2%,52/57)均明显高于MSP((82.9%,63/76)和(73.7%,42/57))(均P<0.05)。MS-HRM在病例组及CRC和AA亚组中甲基化检出率均明显高于FOBT (P<0.05);而在对照组中两者甲基化检出率没有显著差异(P>0.05)。第四部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化的线性和重复性评价对MS-HRM检测各种比例的荧光差异峰值进行线性回归分析发现：P<0.001,R2=0.957(SFRP2), P<0.001, R2=0.954(VIM)。在inter-assay中,SFRP2和VIM的荧光差异值变异系数范围分别为0.0445-0.0678和0.1298-0.1970;在intra-assay中,SFRP2和VIM的荧光差异值变异系数范围分别为0.0716-0.1708和0.1428～0.2605; inter-assay和intra-assay荧光差异值的变异系数都比较小,而且inter-assay中两个目的基因的荧光差异值变异系数都比intra-assay中的小。结论第一部分MS-HRM和MSP检测DNA甲基化的灵敏度分析1. MS-HRM检测SFRP2和VIM基因甲基化的灵敏度均达1%;2.MSP检测SFRP2和VIM基因甲基化的灵敏度均为5%；3. MS-HRM检测SFRP2和VIM基因甲基化的灵敏度要优于MSP。第二部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化来筛查大肠肿瘤患者的可行性分析1.两基因联合检测用于大肠肿瘤的筛查是可行的；2.运用MS-HRM技术检测粪便中SFRP2和VIM甲基化来筛查大肠肿瘤患者是可行的。第三部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化筛查大肠肿瘤患者的性能评价1. MS-HRM、MSP和FOBT对大肠肿瘤的诊断敏感性和特异性分别为93.4%和91.2%,82.9%和73.7%,56.6%和89.5%；2.与传统的甲基化检测技术MSP相比,MS-HRM技术检测粪便DNA甲基化对大肠肿瘤的诊断性能更高；3.与传统的CRC筛查方法FOBT方法相比,MS-HRM检测粪便DNA甲基化的方法对大肠肿瘤的诊断性能更高。第四部分MS-HRM检测粪便DNA甲基化的线性和重复性评价1. MS-HRM的检测结果具有很好的线性；2. MS-HRM检测粪便DNA甲基化的重复性好,检测结果是稳定可靠的。综上所述,MS-HRM检测粪便DNA甲基化是一种潜在的大肠癌筛查方法。