金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人畜共患的一种重要病原菌，可引起多种局部和全身性的感染疾病。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicilin-resistant S. aureus, MRSA）的出现给这些感染性疾病的临床治疗带来了极大的困难。噬菌体（bacteriophage）是一种可以感染细菌的病毒，它利用细菌内的细胞器合成自身所需的生物分子，在感染后期通过自身编码裂解酶所起的水解作用破坏细胞壁，从而杀死细菌释放子代噬菌体颗粒。由于噬菌体与其裂解酶具有快速杀灭特定病原菌的能力，使得二者在治疗耐药菌感染方面表现出极大的应用潜力。本研究拟以金黄色葡萄球菌的噬菌体及其裂解酶作为研究对象，探索噬菌体裂解酶作为治疗制剂的潜力及其裂解作用的分子机制。首先在医学临床分离到多株MRSA菌株，然后以分离到的MRSA菌株为宿主菌对噬菌体进行了分离、纯化和筛选，最终得到了一株具有广谱、高效裂解活性的烈性噬菌体，命名为GH15。对噬菌体GH15的全基因组进行了序列测定，结果表明该噬菌体全长为139.8Kb，共具有214个开放式阅读框（ORF），G+C%为30.23%。比对分析表明GH15与其它金葡菌噬菌体（K、G1、A5W、ISP和Sb-1）同源性较近。但是，在GH15基因组中不存在内含子，而同源性较近的这几个噬菌体分别在不同的基因中含有若干个内含子。内含子相关基因的比对和分析表明有内含子噬菌体和无内含子噬菌体的相关基因在内含子插入位点处具有明显的差异。相关的内含子基因序列与数据库中的任何基因都不具有同源性，因此可以推测这些内含子起源于噬菌体，而非其宿主菌或者其它来源，也就是说GH15很有可能在其它噬菌体基础上发生了内含子的丢失。通过SDS-PAGE和质谱分析共鉴定出GH15的10个结构蛋白，主要为组成衣壳和尾部的相关蛋白。进一步对基因组序列进行分析确定了GH15的裂解酶基因（LysGH15），并对其裂解酶LysGH15进行了表达和纯化。LysGH15对MRSA表现出高效的裂解活性，其最佳作用温度为37°C、最佳作用pH值为7.0；LysGH15表现出比噬菌体GH15更宽的裂解谱，可以裂解所有被检的24株MRSA。通过使小鼠感染MRSA制作了小鼠菌血症模型，对该模型进行治疗的实验中发现50μg的LysGH15即可以有效地治疗处于菌血症状态的小鼠。通过对小鼠血液和脾脏中菌含量进行持续的检测，表明LysGH15可以使菌血症小鼠血液和脾脏内的菌量快速的下降，显示出很强的清除感染细菌的能力，同时还可以降低小鼠体内IL-6、IL-4和INF-γ的mRNA水平。为了揭示LysGH15裂解金葡菌的作用机制，本研究拟对LysGH15蛋白的三维结构进行解析。但是，小角散射和二级结构预测分析表明全长LysGH15是由两个很长的linker连接三个近似球形的活性区域组成，表现出很大的摆动性，无法进行蛋白结晶。因此，分别对LysGH15的三个活性片段（CHAP、amidase-2、SH3b）进行了表达和结构解析。通过结晶条件的初筛和优化最终获得了CHAP片段和amidase-2片段的高质量晶体，并分别通过硒代和泡重原子的方法解析了这两个片段的三维结构。依据CHAP片段结构进行的位点突变、原子发射光谱分析（ICP-AES）、等温滴定量热法（ITC），thermal shift，圆二色谱分析（CD）和活性实验表明：CHAP可以通过5个氨基酸残基结合一个Ca2+，其中D45、D47和D56的侧链在结合Ca2+中起关键作用；Ca2+的丢失不会影响CHAP的二级结构，但是对其热稳定性具有轻微影响，它与CHAP的解离平衡常数为27μM；Ca2+在CHAP的裂解活性中起关键的调节作用，一旦丢失，将使CHAP失活；C54-H117-E134-N136四联体为CHAP的活性中心，其中C54的巯基起主要的攻击作用。通过amidase-2的结构可以看到H214、H324和C332三个氨基酸残基的侧链可以结合一个Zn2+，另外通过序列和结构的比对确定了与活性有关的氨基酸位点为E282和T330，并通过突变后的活性实验进行了进一步的验证。由于无法获得SH3b片段的晶体，所以采用了核磁共振技术对该片段进行了结构解析。首先表达了15N和13C单标和双标的SH3b蛋白，通过核磁共振技术获得了二维谱数据，通过计算、分析和优化最终获得了SH3b在溶液状态下的三维结构。核磁滴定与突变实验鉴定了SH3b与底物多肽“AGGGGG”相互作用的界面和关键氨基酸位点。在全长LysGH15蛋白水平对结构相关研究得出的结论进行了验证：将LysGH15上的C54突变为丝氨酸，结果LysGH15完全失活，结合Ca2+关键位点的突变也会对全长LysGH15的活性产生同样的影响，表明CHAP片段在全长的裂解活性中起关键作用；将全长LysGH15中的E282突变为丙氨酸，结果LysGH15的活性无明显的变化，表明amidase-2在全长的活性中所起的作用很小；将LysGH15中SH3b结合相关的位点进行突变，结果可以显著影响全长的活性，表明SH3b的结合活性在全长活性中起很大作用。综上，CHAP的水解活性与SH3b的结合活性共同促成了LysGH15的高效裂解活性。