研究背景：骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，主要发生于长骨干骺端，尤其是股骨远端和胫骨近端。随着化疗药物应用，目前已形成术前新辅助化疗+手术+辅助化疗的模式，骨肉瘤患者的5年生存率也由20世纪70年代的不足20%上升至目前的80%左右，但转移及复发患者的预后仍然极差，而且随着化疗的次数增多，患者对常规的化疗药物会产生多药耐药（multidrug resistance, MDR），从而导致治疗失败。骨肉瘤常用抗肿瘤药物发生耐药机制还没有明确的定论，目前研究表明耐药的发生由多因素、多水平、多基因参与调控的，如何能高效快捷的对耐药表型的整个基因组规模变化进行研究，从而找到肿瘤耐药发生的关键致病因子及这些致病因子之间的相互作用网络是有待解决的重要问题。因此，采取以功能为基础，基于表型的高通量筛选策略来获得和耐药相关的众多重要分子，探索这些分子之间的相互作用及网络调控，从而阐明耐药发生的分子机制具有重要意义。　　既往科学家使用全基因组RNAi文库进行高通量基因功能分析获得成功，最近也有报道通过CRISPR文库进行功能获得性筛选的经验。因此，我们认为利用随机调节性小RNA（rsRNA）文库的筛选方法可以筛选出表达水平被特异 rsRNA调控后引起肿瘤耐药的分子。顺铂是临床治疗骨肉瘤最常用化疗药物之一，筛选顺铂耐药相关分子并对其机制进行研究，具有重要临床应用价值。该文库的构建及应用为骨肉瘤耐药的研究提供了新的手段，为全面理解肿瘤耐药的机制带来了新的契机。新的骨肉瘤多药耐药分子的发现和研究，将为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。　　目的：1.构建随机rsRNA逆转录病毒文库。2.在骨肉瘤细胞143B中进行耐药表型筛选。3.验证rsRNA对骨肉瘤细胞耐药的作用。4.探讨候选靶分子在骨肉瘤细胞顺铂耐药中的作用及其可能的分子机制。　　方法：1.利用分子克隆技术构建rsRNA文库逆转录病毒载体质粒，采用琼脂糖平板克隆计数、菌落 PCR检测、质粒DNA测序等方法鉴定。2.rsRNA文库文库包装为逆转录病毒，将此病毒文库感染骨肉瘤细胞143B，加入顺铂进行耐药筛选，并使用WST-1、结晶紫染色、克隆形成实验、迁徙及侵袭实验、Hoechst检测凋亡、细胞周期检测、qPCR等技术进行耐药表型验证。3.提取耐药细胞基因组 DNA，高通量测序获得富集rsRNA片段，验证rsRNA片段的作用。4.通过生物信息学分析获得骨肉瘤耐药的相关lncRNA，通过qPCR对候选lncRNA表达量进行检测，构建靶分子干扰载体转导进耐药细胞，检测药物敏感性变化，并探讨其介导骨肉瘤耐药的可能机制。　　结果：1.成功构建随机rsRNA逆转录病毒文库。通过化学法合成中间含有29个碱基但是随机排列的片段，通过PCR扩增并形成双链DNA作为Gibson组装的原始片段。以逆转录病毒骨架pSOKd质粒为载体，在该质粒U6-H1启动子之间通过Gibson组装的方法，成功将含有随机排列29个碱基的RNA片段组装进入该质粒中。经电转涂板、菌落计数、菌落PCR验证以及质粒测序等方法，计算出该rsRNA文库质粒一次组装的数目约为1.07×107左右，质粒阳性率为95%，随机挑选的20个阳性菌落质粒测序没有一个发生重叠。2.利用随机rsRNA逆转录病毒文库筛选骨肉瘤耐药细胞。（1）50ug随机rsRNA文库质粒转染293PA细胞后包装为逆转录病毒，感染骨肉瘤143B细胞，加入 BSD及顺铂逐渐增量进行筛选，4个月后获得耐药细胞株。（2）耐药细胞株的增殖速度显著低于亲本细胞，半数致死剂量明显高于亲代细胞。（3）结晶紫染色显示耐药细胞对顺铂有更强的耐药性，且对异环磷酰胺，阿霉素，甲氨蝶呤具有一定程度的交叉耐药性。（4）耐药细胞克隆形成能力更强，迁徙及侵袭能力高于亲本细胞。（5）药物作用情况下，耐药细胞发生凋亡的比例明显低于亲本细胞，细胞周期分析显示顺铂将亲本细胞阻滞在G1期。（6） qPCR检测结果显示耐药细胞中多个与耐药相关的基因（ABCB1、ABCC1、ABCC2、LRP、GST-π、ATP7B、CTR2等）均明显升高，干性及上皮间质转化（EMT）增强。3.rsRNA片段在骨肉瘤耐药中的作用。（1）将文库筛选后获得的耐药细胞提取基因组DNA进行高通量测序后，获得3个高度富集的rsRNA片段。（2）在亲本细胞中将片段单一过表达或联合过表达，均能不同程度增强细胞对顺铂的耐药性。4.生物信息学分析寻找骨肉瘤细胞顺铂耐药相关lncRNA及机制探讨。（1）通过Ensemble blast找到10个候选lncRNA。（2）常规RT及基因特异性RT后使用qPCR检测，10个lncRNA在耐药细胞中均表达升高。　　结论：我们构建了一个完全随机的rsRNA逆转录病毒文库，并利用此文库进行高通量筛选，对骨肉瘤顺铂耐药相关分子进行了以表型为基础的功能筛选。通过筛选，得到3个rsRNA片段，经过反向验证，片段能发挥耐药作用。生物信息学分析发现10个与骨肉瘤细胞顺铂耐药相关的lncRNA。该文库为骨肉瘤耐药的研究提供了新的手段，为深入全面理解肿瘤耐药机制带来了新的契机，将为骨肉瘤的治疗提供新的靶点和预后指标。