进入21世纪,人类对能源的依赖程度进一步加大。随之而来的是石油等化石能源的可利用性逐渐下降,并由此带来的环境污染问题日益凸显。近年来由于全球能源和环境问题不断升级,绿色可持续的生产方法逐渐涌现,其中由微生物发酵法生产的化学品种类逐渐增多。微生物发酵具有众多的优点:原材料廉价,环境污染少,产品纯度高等。乙偶姻(Acetoin)和乳酸(Lactic acid)因其广泛应用于食品、化妆品以及化合物的合成等领域,其生产方法引起了极大的关注。代谢工程改造微生物利用生物质能源,生产乙偶姻和乳酸不仅可以实现减少对石油资源的依赖,而且有利于实现环境友好型的可持续发展模式。乙偶姻分子中有羟基和酮基两个活跃的化学基团,容易进行化学反应。它不仅可作为四甲基吡嗪等众多化合物合成的前体物质,还可作为一种螯合剂稳定醇盐等。乳酸最重要的应用是作为化学合成聚乳酸(PLA)的单体。聚乳酸具有生物降解性、生物相容性、以及良好的控制药物释放曲线等的优良特性,在医疗、制药等领域具有广阔的的应用前景。另外,在食品行业,乳酸可作为食品添加剂改善食品的风味和口感;在医药领域,因其具有亲水性能溶解蛋白质等难容药物,能够促进机体对药物的吸收。论文的第二章以地衣芽孢杆菌MW3 MW3)为出发菌株,代谢葡萄糖生成丙酮酸,并进一步转化生成乙偶姻和2,3-丁二醇。乙偶姻是2,3-丁二醇生成过程的中间代谢产物。前期研究发现,地衣芽孢杆菌MW3在发酵过程中仅积累少量的乙偶姻。实验室前期研究已经确定了地衣芽孢杆菌MW3中2,3-丁二醇生成过程中的关键酶:2,3-丁二醇脱氢酶和甘油脱氢酶。它们分别由基因budC和gdh编码,其中2,3-丁二醇脱氢酶催化乙偶姻生成(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇,甘油脱氢酶催化乙偶姻生成(2R,3R)-2,3-丁二醇。因此,通过代谢工程改造,敲除与乙偶姻代谢相关的基因budC和gdh能够达到积累乙偶姻的目的。另外,地衣芽孢杆菌在发酵过程中会形成芽孢,芽孢的形成会降低菌体的生产效率从而影响产物的生成。我们通过敲除其芽孢形成的转录调节因子的基因spo0A,最终得到工程菌MW3(ΔbudC Δgdh ΔSpo0A)。以葡萄糖为碳源进行补料分批发酵,最终经过36 h的发酵,乙偶姻的产量达到61.77 g/L,得率是0.38 g/g。本章通过对地衣芽孢杆菌的代谢工程改造扩大了其在乙偶姻生产领域的应用。论文的第三章以构建好的工程菌地衣芽孢杆菌MW3(ΔbudC Δgdh Δspo0A)为出发菌株,以乙偶姻作为筛选压力经过连续的转接传代进行人工代谢进化。本章中出发菌株能够生产乙偶姻,但是由于其耐受性不够,而使得乙偶姻的最终产量无法进一步提高。因此在高浓度的乙偶姻压力下,对乙偶姻耐受性高的菌株会存活下来并成为优势菌。另一方面高浓度的乙偶姻可能会抑制乙偶姻的生产,并导致其它产物的生成。本章代谢进化后的菌株出现了新的特性,原本产量较少的乳酸成为进化后菌株的主产物。验证结果表明:进化过程改变了菌体内乳酸脱氢酶的活性,其活力由最初的0.06 U/mg提高到了 0.74 U/mg。在其发酵过程中,仍有乙偶姻的产生。在乙偶姻的生成过程中,转录调控因子A1sR调控操纵子alsSD的表达,阻断了 A1sR的表达就会抑制alsSD的转录过程。由于alsSD的激活是乙偶姻生产的关键所在,敲除alsR基因就可阻断乙偶姻的生产,使菌体内丙酮酸更多的流向目的产物—乳酸。因此,我们敲除MW3(ΔbudC Δgdh Δspo0A)驯化后的菌株中的alsR基因,获得了目的菌株MW3(ΔbudC Δgdh Δspo0A驯ΔalsR)。以葡萄糖为碳源进行补料分批发酵,发酵48 h生成L-乳酸156.53 g/L,得率是0.91 g/g。本章通过对地衣芽孢杆菌进行人工代谢进化和基因工程改造,不仅增加了地衣芽孢杆菌生产应用范围,也为乳酸的生产提供了新的菌种资源。