【摘 要】
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研究目的:代谢重编过程在肿瘤发生发展中发挥重要作用,其中丝氨酸代谢重编是肿瘤代谢的显著特征之一。Yes-associated protein（YAP）是Hippo信号通路下游关键效应蛋白辅助转录激活因子,参与调控器官大小、促进肿瘤发生、维持组织稳态等过程,并与肿瘤代谢密切相关。但YAP在胃肠道中与丝氨酸代谢的关系目前还没有相关研究报道。肿瘤耐药是导致临床治疗失败的原因之一,但是胃肠道肿瘤耐药发生发
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研究目的:代谢重编过程在肿瘤发生发展中发挥重要作用,其中丝氨酸代谢重编是肿瘤代谢的显著特征之一。Yes-associated protein（YAP）是Hippo信号通路下游关键效应蛋白辅助转录激活因子,参与调控器官大小、促进肿瘤发生、维持组织稳态等过程,并与肿瘤代谢密切相关。但YAP在胃肠道中与丝氨酸代谢的关系目前还没有相关研究报道。肿瘤耐药是导致临床治疗失败的原因之一,但是胃肠道肿瘤耐药发生发展的分子机制及其与丝氨酸代谢的关系并不明确。研究方法:将肠癌细胞长时间培养于无丝氨酸的培养基中,构建丝氨酸缺乏耐受细胞;通过CCK-8和细胞克隆实验检测细胞活性和增殖能力;流式细胞技术和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;RNA-Seq和代谢组学分析基因转录和代谢产物的变化;采用蛋白免疫印迹法和q RT-PCR检测细胞蛋白和m RNA表达水平;免疫共沉淀实验检测USP7与YAP的相互作用;构建肠癌类器官并用H＆E染色和免疫组化检测类器官的形态和来源;微球菌核酸酶消化实验检测DNA损伤。研究结果:在肠癌中,我们成功构建丝氨酸缺乏耐受细胞,KEGG分析富集RNA-seq及代谢组学数据发现“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸”代谢通路被显著上调。PHGDH抑制剂CBR-5884抑制丝氨酸代谢途径,丝氨酸缺乏耐受细胞增殖受阻。这表明激活的“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸”代谢途径是满足丝氨酸缺乏耐受细胞生长增殖物质需求所必需的。接着,我们发现细胞在短期丝氨酸缺乏应答时,YAP被磷酸化,其活性被抑制;而长期丝氨酸缺乏应答时,YAP去磷酸化激活,其下游靶基因表达水平被上调。与丝氨酸缺乏耐受细胞表现结果一致,高浓度丝氨酸也促进YAP蛋白表达,并增强YAP蛋白稳定性。然后,Co-IP结果显示USP7与YAP相互作用,并且YAP与USP7之间的结合作用被高浓度丝氨酸加强。我们过表达USP7,发现YAP泛素化修饰水平降低;用si-RNA沉默USP7表达,发现YAP蛋白表达水平下调且该作用被MG132逆转。TCGA数据库分析结果显示,YAP在结直肠癌组织中表达显著,并与结肠癌患者总生存率（Overall Survival;OS）呈负相关性,但与肿瘤分期无关。抑制YAP,细胞和类器官增殖被阻碍,细胞中USP7的表达水平下调,并且这种作用可以被高浓度丝氨酸加强。最后,发现YAP靶基因在结直肠癌肿瘤组织中上调,并与PHGDH和USP7的表达呈正相关。在胃癌细胞中,降低丝氨酸浓度或用NCT-503和CBR-5884抑制PHGDH,铂类药物对胃癌细胞的毒性及促凋亡作用降低,而增加丝氨酸浓度逆转胃癌细胞对铂类药物的耐药性。进一步探究发现,抑制丝氨酸代谢降低H3K4 me3的表达水平,增强染色质的质密性,减弱DNA损伤程度,而H3K4去甲基化酶抑制剂JIB-04可逆转这一现象,进而促进胃癌细胞对铂类药物的敏感性。研究结论:本研究一方面阐明了YAP在调控肠癌细胞生长增殖过程中的关键作用及丝氨酸代谢通过USP7调控YAP表达的机制。另一方面,阐明了丝氨酸代谢通过调控H3K4 me3修饰水平及DNA损伤程度促进胃癌铂类化疗药物耐药的机制。这些发现使丝氨酸代谢调控联合YAP抑制剂或铂类药物成为治疗胃肠道肿瘤的新思路。
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