研究背景 原发性肝癌是各类癌症细胞中恶性程度极高、且预后是最差的一类,俗称“癌中之王”。亚洲东南部、非洲肝癌发生率一直保持较高的水平,欧洲和美国肝癌发病率也一直较高。国内目前原发性肝癌患者人数约为全球肝癌总人数的50%以上,年均约有11万人死于该类疾病。在我国乙肝病毒和丙肝病毒感染是肝癌发生的主要病因。临床治疗肝癌存在确诊多为中晚期、早期确诊困难、预后极差以及高复发转移率的主要问题。早期诊断和治疗是治疗肝癌的有效方法,但目前缺乏可靠的临床筛选方法。约三分之二的肝癌患者在得到诊断的时候已经处于肝癌晚期。肝癌对多数的化疗药物均会出现化疗耐药,即使接受过手术的患者多数会发生复发和转移,五年生存率为30-40%。因此更好的明确肝癌发病机理有助于更好的探究治疗方法有效性和早期诊断指标。miR-26a位于人3号染色体,全长21个核苷酸,包括miR-26a-1, miR-26a-2和miR-26b。miR-26a-1, miR-26a-2 and miR-26b多种组织中具有表达,表达也不存在特异性。研究发现鼻咽癌、肺癌、乳腺癌研究中均发现miR-26a的抑癌作用。miR-26a在上述肿瘤中的作用已经获得一定的研究证实,过表达miR-26a可以通过调控下游靶基因进一步抑制上诉恶性肿瘤细胞的增殖。考虑到miR-26a与肿瘤相关性非常高、关系密切,由此提出将miR-26a作为肝癌治疗的切入点。通过查阅文献发现,治疗性的miR-26a传递采用腺相关病毒(AAV)载体可抑制癌细胞形成,诱导肿瘤细胞凋亡,阻断疾病进程,而没有明显副作用。IFN-α治疗可以升高患者肿瘤内miR-26a表达,改善肝癌患者的总生存。而干扰素是目前治疗肝细胞癌的免疫治疗方案之一,相对副作用小,有效率并不亚于传统药物化疗。这两个证据提示IFN-α可能通过提升肿瘤内miR-26a表达来起到抑制肿瘤生长的作用。EZH2作为miR-26a潜在靶基因,而EZH2可甲基化组蛋白H3赖氨酸27(H3K27)及调控转录基因沉默。前期研究表明沉默肿瘤细胞中EZH2基因表达可以抑制nude小鼠模型中肿瘤发生,体现出抑制EZH2在肝癌中的潜在治疗作用。近年来研究显示肝癌组织中EZH2高表达与与肝癌侵袭性或预后不良有关。但是肝癌对IFN-α治疗敏感性的机制研究目前还不清楚,需要进一步阐明IFN-α治疗产生的肝癌细胞内的链式反应。目的探讨miR-26a在原发性肝癌发生、发展及转移中的作用机制；明确肝癌细胞中miR-26a及EZH2与正常肝脏细胞表达差异情况；明确miR-26a在原发性肝癌生物学行为中的直接作用目的靶基因；通过调控miR-26a的表达水平分析其对肝癌细胞增殖和迁移的影响,并探讨干扰素-α在原发性肝癌治疗中的作用机理,为阐明原发性肝癌的发病机制和新的分子靶向治疗提供可参考数据和理论思路。方法首先检测并分析正常小鼠肝细胞株和肝癌细胞株(人,小鼠)、临床肝癌组织及癌旁组织中miR-26a和EZH2的表达情况。其次采用荧光素酶检测,构建pGL3-EZH2-3’UTR野生型质粒和突变型质粒,转染miR-26a及抑制物,通过双荧光素酶测定活性,以明确EZH2是否为miR-26a的直接作用目的靶基因。最后利用qRT-PCR, Western blot及Northern blot技术,检测干扰素-α对肝癌细胞中miR-26a及EZH2表达的影响,并观察该影响是否有剂量依赖性；并利用miR-26a模拟物及miR对照物转染HepG-2肝癌细胞,进一步检测过表达miR-26a对EZH2表达的影响,以及过表达miR-26a在体外实验中对肝癌细胞增殖和迁徙的抑制作用。结果1.与正常肝细胞株比较,4种肝癌细胞株中miR-26a表达显著下调；同样,miR-26a在原发性肝癌组织中的表达也明显低于癌旁组织。而EZH2在人肝癌细胞SMMC-7721和HepG-2中的表达与正常肝细胞比较,具有显著上调特点；同样,EZH2在癌旁组织中的表达量显著低于原发性肝癌组织。miR-26a和EZH2在肝癌细胞和原发性肝癌组织中的表达呈负相关,提示两者间存在负调控关系。2.采用TargetScan生物学软件分析miR-26a与EZH2间关系,发现miR-26与EZH2的3’UTR之间存在7个碱基呈现完全的互补配对,同时发现EZH2-3’UTR中存在4个碱基突变位点。通过转染miR-26a可以显著抑制了野生型EZH2-3’UTR报告基因质粒的荧光素酶活性,但对于EZH2-3’UTR突变序列报告基因质粒的荧光素酶活性改变不具显著性差异；而转染miR-26a抑制剂可以明显增加野生型EZH2-3’UTR报告基因质粒的荧光素酶活性,而对EZH2-3’UTR突变序列报告基因质粒的荧光素酶活性改变无统计学差异。小鼠正常肝细胞BNL CL.2和小鼠肝癌细胞Hepal-6中过表达miR-26a后,可以明显抑制EZH2的mRNA水平,而抑制miR-26a表达则可以显著增加EZH2的mRNA水平。上述结果提示,miR-26a可直接作用于EZH2,转录后可抑制EZH2表达。3.mir-26a通过阻断EZH2促进干扰素-α抑制肝癌增殖和迁移3.1肝癌细胞中IFN-α促进miR-26a表达降低EZH2表达肝癌细胞HepG2给予IFN-α治疗0h、12h、24h和48h后,采用qRT-PCR方法测定miR-26a和U6表达。治疗12h后miR-26a相对于U6表达水平显著升高,治疗24h后升至最高,一直维持到48h。应用Northern印迹杂交测定miR-26a表达,可见miR-26a相对于U6表达水平百分比与以上结果相同,24h和48h的miR-26a表达百分比与0h处理后相比差异具有统计学意义。同样评价IFN-α干预后EZH2的mRNA转录水平,IFN-α治疗24h和48h后EZH2的mRNA表达水平显著降低。与102 IU的IFN-α相比,103 IU的IFN-α更能抑制EZH2mRNA表达水平。其次测定肝癌细胞中EZH2蛋白表达,IFN-α抑制EZH2蛋白表达呈现剂量依赖性,特别是103 IU的IFN-α, EZH2表达比阴性对照比较降低近34%。3.2肝癌细胞HepG-2中上调miR-26a阻断EZH2表达为了探讨miR-26a和EZH2相关性,HepG2细胞分别转染同等剂量的miR-26a模拟物或miR对照。无论20mM还是40mM, miR-26a模拟物组中相对miR-26a水平显著高于miR对照组,可见肝癌细胞中miR-26a模拟物剂量和相对miR-26a水平存在剂量影响关系。其次,检查肝癌细胞转染24h后EZH2相对于P-actin的mRNA水平,可见miR-26a模拟物组和miR对照组间存在显著性差异,转染72h后EZH2的mRNA表达稳定。最后,应用蛋白印迹分析转染后不同时间点的EZH2表达水平,三个时间点对照组和miR-26a组间存在显著差异。结果表明上调miR-26a可抑制EZH2转染水平的表达。3.3 miR-26a诱导细胞生长抑制,降低HepG-2细胞迁移和侵袭为了探讨miR-26a对细胞增殖的影响,HepG-2细胞分别短暂转染miR-26a模拟物和miR对照。MTT结果表明miR-26a模拟物抑制HepG-2细胞增殖,转染后48h抑制率为33%,72h抑制率为50%,P<0.05。观察HepG2细胞上miR-26a模拟物转染对细胞生长的抑制作用,平板克隆形成试验表明,与对照组相比,miR-26a模拟物组少见小群体。分析miR-26a对肝癌细胞侵袭和迁移的影响,HepG2细胞迁移和侵袭用于分析。结果表明转染48h后,上调miR-26a表达显著抑制HepG2细胞迁移和侵袭。miR-26a模拟物组迁移细胞数量与对照组比较降低36%。与对照组比较,miR-26a组侵袭细胞数量分别下降37.5%和62.5%。HepG-2细胞分别转染25nnM和50nnM模拟物。结果表明miR-26a在HepG-2细胞转移中扮演抑制作用。结论1.在体外肝癌细胞及临床肝癌组织标本中miR-26a表达明显降低,而EZH2表达显著增高；2.在肝细胞癌中EZH2是miR-26a作用的靶基因,两者间存在负性调节；3.IFN-α体外诱导肝癌细胞miR-26a上调进而抑制EZH2表达；引入miR-26a模拟物可降低靶基因EZH2表达,从而抑制肝癌细胞的增殖及迁移。IFN-α可能通过上调miR-26a来抑制EZH2表达,进而抑制肝癌细胞增殖和迁移。