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目的:在口腔正畸治疗过程中,施加适当的机械力作用于牙齿,首先引起牙周膜组织的改建,进而发生牙槽骨改建,最终使牙齿发生位移而达到矫治的目的。牙周膜是位于牙槽骨和牙骨质之间的一种特殊结缔组织,发挥牙齿支持、营养、感知以及牙周组织修复功能。牙周膜成纤维细胞(periodontal fibroblast cells,PDLFs)是牙周膜组织中最重要的细胞,具有干细胞特性,能够分化为成骨细胞、牙骨质样细胞以及脂肪细胞。PDLFs是最先接受正畸力的细胞,通过一些生物化学信号(细胞因子、前列腺素类及神经递质)诱导PDLFs成骨向分化,协助正畸过程中骨组织的重建,已成为正畸学者所普遍关注的问题。银纳米粒子(silver nanoparticles,AgNPs)是直径范围为1-100nm的零价银离子,具有广谱抗菌作用,且不会产生耐药性,已经广泛应用于医疗领域,特别是在整形外科植入物方面被广泛应用。研究表明AgNPs具有促进细胞分化的作用。AgNPs可以促进哺乳动物骨髓间充质干细胞的成骨分化。另外,AgNPs促进成纤维细胞分化为肌纤维母细胞,从而促进伤口收缩愈合。AgNPs对PDLFs分化的作用,尚不明确。本研究拟采用体外细胞实验来研究AgNPs对hPDLFs成骨分化的影响以及具体的分子机制,为如何在安全而有效的前提下提高牙槽骨改建的效率,进而加速正畸牙齿移动,缩短矫治疗程提供重要的参考。方法:1、常规分离培养原代人牙周膜成纤维细胞,通过免疫细胞化学染色细胞角蛋白和波形蛋白进行细胞鉴定;化学还原法制备AgNPs,以不同的浓度(0μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM)AgNPs作用于hPDLFs,MTT检测细胞活力,确定AgNPs的适当作用浓度范围,并观察AgNPs对细胞形态的影响;2、不同浓度的AgNPs(0μM、25μM、50μM、100μM)处理hPDLFs,并进行成骨诱导,碱性磷酸酶(ALP)活性检测确定不同浓度AgNPs作用下hPDLFs中ALP活性变化;茜素红染色鉴定各组细胞矿化结节形成情况;Real-time PCR及Western blot检测成骨细胞分化标志物(ALP、collagen-I、Runx2、OCN、OSX)mRNA及蛋白表达水平;3、100μM AgNPs处理hPDLFs并成骨诱导1d-7d,Western blot检测各组细胞总Akt和p-Akt蛋白表达、RhoA活性及表达以及TAZ蛋白表达情况;加入PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002)预处理,检测ALP活性变化,Real-time PCR检测各组细胞ALP、Runx2和collagen-I mRNA表达。加入Rho抑制剂(C3 toxin)预处理,检测ALP活性变化,应用Real-time PCR及Western blot检测各组细胞ALP、Runx2和collagen-I mRNA及蛋白的表达;瞬时转染siTAZ和siCon(对照组),沉默TAZ在hPDLFs中的表达,加入AgNPs后成骨分化诱导培养,检测ALP活性变化,以及各组细胞RhoA活化及ALP、Runx2和collagen-I表达情况。结果:1、免疫细胞化学染色显示培养细胞角蛋白染色呈阴性,波形蛋白染色呈阳性,可鉴定为成纤维细胞(hPDLFs);MTT检测结果显示250μM及500μM AgNPs对hPDLFs细胞活力存在显著抑制。25-100μM AgNPs对细胞活力没有影响,100μM AgNPs对细胞形态没有影响。2、与未经AgNPs处理组相比较,100μM AgNPs作用7 d后,hPDLFs中ALP活性显著增加(P<0.01);经25μM-100μM AgNPs孵育7 d后,hPDLFs中ALP、Runx2、OCN、OSX和collagen-I mRNA的表达呈浓度依赖性升高,Western blot检测结果与之一致。3、100μM AgNPs诱导hPDLFs细胞3 d-7 d,Akt磷酸化水平上调,该现象受到PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002)的逆转。此外,LY294002预处理7d,抑制了AgNPs诱导的ALP活性的升高,并逆转了AgNPs诱导的ALP、Runx2以及collagen-I mRNA表达水平的上调;100μM AgNPs诱导hPDLFs细胞5 d-7 d,RhoA的活性以及TAZ的表达水平上调,该现象受到RhoA信号通路抑制剂(C3 toxin)的逆转,用C3预处理7d,抑制了AgNPs诱导的ALP活性的升高,并逆转了AgNPs诱导的TAZ、Runx2以及collagen-I mRNA及蛋白表达水平的上调;与siCon转染的细胞相比,siTAZ转染下调了hPDLFs中TAZ的表达,但并不影响AgNPs诱导的RhoA激活。此外,siTAZ转染逆转了由AgNPs诱导的ALP活性和ALP mRNA表达的升高,与此相一致,siTAZ转染也消除了AgNPs诱导的Runx2以及collagen-I mRNA和蛋白水平升高。结论:1、25-100μM浓度的AgNPs为hPDLFs的安全作用浓度,用于后续实验。2、AgNPs促进hPDLFs成骨向分化。3、PI3K/Akt信号通路参与AgNPs调控的hPDLFs成骨向分化进程;此外,AgNPs还通过RhoA-TAZ轴发挥促进hPDLFs成骨向分化的作用。