淀粉样蛋白聚集成不溶性的淀粉纤维可导致各种疾病,如阿尔茨海默病、帕金森病和2型糖尿病(T2DM)等。T2DM患者胰腺中人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP)聚集形成的淀粉样蛋白沉积物为其主要病理特征。hIAPP单体聚集形成富含β-折叠结构的聚集体导致胰岛β细胞功能障碍和死亡并最终引发T2DM。因此,如何抑制hIAPP聚集就成为攻克T2DM的研究热点。目前体外实验所用的hIAPP大多采用固相化学合成法(SPPS)制备,但合成过程中残留的氨基酸和短肽严重影响hIAPP的聚集特性和毒性。基于hIAPP的氨基酸序列,本研究首先在目的蛋白和融合标签(GST和MBP)之间添加蛋白Linker和Factor Xa/TEV蛋白酶切位点。然后按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成hIAPP基因,并克隆到不同的表达载体中。通过转化获得含有目的基因的重组质粒pET22b-His-GST-hIAPP和pMAL-hIAPP。重组质粒经双酶切和基因测序验证。将验证正确的重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中。利用试剂盒提取质粒并以提取的质粒为模板进行PCR验证,验证正确的工程菌用于后期诱导发酵。为了提高融合蛋白的表达量,系统研究了温度和诱导时间对目的蛋白表达的影响。发现菌浓OD600为0.4,12℃诱导32 h是该工程菌的最佳诱导条件。将构建好的工程菌挑取单菌落接种于5 mL LB试管(氨苄青霉素抗性终浓度为50μg/mL)。培养12 h后取1 mL(2%的接种量)转接到50 mL LB培养基中(氨苄青霉素抗性终浓度为50 μg/mL),37℃培养至菌体浓度达到OD600为0.4～0.8,加诱导剂 IPTG至终浓度0.5 mmol/L,12℃、120 r/min摇床诱导发酵30～34 h。诱导发酵后离心收集菌体,低温超声破碎,利用亲和层析镍柱纯化融合蛋白。利用TEV蛋白酶将融合蛋白MBP-hIAPP切开。首先研究了酶切条件对酶切的影响,发现16℃条件下反应6 h是最佳的酶切条件。进一步利用尺寸排阻色谱分离纯化hIAPP。然后电泳分析分离得到的hIAPP单体。并利用MALDI-TOF质谱验证其分子量为3931.57,与hIAPP的理论分子量一致。最后利用Nanodrop测定hIAPP浓度并计算出hIAPP产量约为4～6mg/L。生物合成获得hIAPP单体后,用于体外研究其聚集特性和细胞毒性,为治疗2型糖尿病提供靶向药物。