实验目的：本课题主要分为两部分,第一部分以2H2O作为示踪剂标记动物体内白蛋白,以期建立2H2O标记丙氨酸的检测方法,为研究蛋白质分数合成率提供方法保证；第二部分为研究在日常饮食状态下,大鼠在较长时间内摄入含有低(0.2%)、正常(0.9%)、高(1.6%)赖氨酸饲料,血液白蛋白的代谢动力学是否一致,白蛋白的分数合成率是否相同,分析血浆白蛋白代谢动力学指标是否对赖氨酸摄入量敏感,为进一步研究对赖氨酸摄入量较敏感的检测指标建立方法体系,从而为确定人体赖氨酸需要量的研究奠定基础。实验方法：(1) 重水短时间(90min)标记大鼠,分离血浆。(2) 采用三氯乙酸/乙醇法对大鼠血液白蛋白进行初步提纯,并清除表面残留游离氨基酸。(3) 经SDS-PAGE鉴定提纯蛋白为白蛋白。(4) 酸水解法水解白蛋白,收集水解后丙氨酸,同时收集血液游离丙氨酸。(5) 对两种来源丙氨酸进行分离和纯化。(6) 对丙氨酸进行衍生化处理,经GC/MS检测,确定了重水标记丙氨酸检测方法的可行性。(1) 参考AIN-93G各成分比例设计大鼠纯化饲料,三种饲料赖氨酸含量分别为低(0.2%)、正常(0.9%)、高(1.6%)。生产后随即检测饲料氨基酸组分。(2) 健康成年雄性SD大鼠72只,12周龄,体重320g左右,随机分为3组,每组24只。分别给予低赖氨酸(0.2%)饲料、正常赖氨酸(0.9%)饲料和高赖氨酸(1.6%)饲料,其他营养成分均按常规标准给予,喂养8w,自由进食。(3) 自第9周开始,给予每组大鼠2H20以标记血液游离丙氨酸、血液白蛋白,标记至18周结束。18周内的每周最后一天称量大鼠体重并记录每组每周进食量。(4) 在8,9,11,13,14,18周处死大鼠,收集血液,作为样本,用ALB试剂盒检测血液白蛋白含量,三氯乙酸/乙醇法提纯血液白蛋白并用SDS-PAGE电泳鉴定、将提纯的白蛋白水解、分离纯化其中的丙氨酸、并将丙氨酸衍生,用GC/MS检测血液白蛋白中的2H-丙氨酸的丰度和血浆游离丙氨酸中2H的丰度。(5) 分别绘制各组大鼠血液白蛋白中2H示踪剂的变化趋势图,计算2H标记白蛋白的代谢动力学方程和蛋白质的合成率,比较不同膳食赖氨酸组所得结果的异同,分析不同赖氨酸摄入水平对机体白蛋白代谢动力学具有怎样的影响。结果：腹腔注射重水90min后,3只大鼠血浆白蛋白中丙氨酸衍生物的分子量为144、159基团的丰度均可测出,且结果具有一致性。(1) 经检测,三种饲料中赖氨酸含量分别为：0.23g/100g、0.89 g/100g、1.61 g/100g,符合实验要求。(2) 低剂量赖氨酸能明显减少大鼠的进食量,高剂量赖氨酸组大鼠的进食量与正常赖氨酸组无差别。(3) 三组大鼠体重均值具有显著性差异,由小到大排序依次为：低剂量赖氨酸组,正常剂量赖氨酸组,高剂量赖氨酸组。(4) 低剂量赖氨酸组血浆白蛋白含量与正常剂量赖氨酸组无差别,高剂量赖氨酸组血浆白蛋白含量显著高于正常剂量赖氨酸组和低剂量赖氨酸组。(5) 低剂量赖氨酸组的血浆白蛋白分数合成率为13.8%,正常剂量赖氨酸组血浆白蛋白分数合成率为15.3%,高剂量赖氨酸组血浆白蛋白分数合成率为35.5%。(6) 白蛋白合成动力学方程为：低剂量赖氨酸组正常剂量赖氨酸组高剂量赖氨酸组结论：(1) 腹腔注射重水90min后,即能检测出血浆白蛋白中的丙氨酸被氘标记,说明该方法能够成功标记血浆白蛋白,符合本研究需要。(2) 在18周实验期内,以正常赖氨酸(0.9%)摄入量大鼠的血浆白蛋白分数合成率为对照,低赖氨酸(0.2%)摄入量使大鼠血浆白蛋白分数合成率略有降低,高赖氨酸(1.6%)摄入量会明显提高大鼠白蛋白的分数合成率。从血浆白蛋白分数合成率、白蛋白合成动力学方程及曲线图可知,白蛋白的分数合成率和代谢动力学方程能敏感反映机体的高赖氨酸摄入状态,但对低赖氨酸摄入状态不敏感。