干细胞是生物学和医学研究领域中的热点之一。随着对干细胞研究的不断深入,干细胞在组织工程学和再生医学中的应用逐渐成为可能。但是,干细胞在体内的数量极少且体外培养又极易不定向分化。因此,如何在体外扩增过程中维持干细胞的多潜能性成为亟待解决的问题。Oct4是干细胞全能性的标志物之一,在干细胞多潜能性和自我更新中具有十分重要的地位。并且在诱导成体细胞去分化成为多潜能干细胞的过程中,Oct4亦发挥不可替代的作用。本文以Oct4的启动子和Oct4 m RNA 3’UTR为靶点,筛选可促进Oct4表达的天然小分子化合物,并对其在维持干细胞多潜能性中的作用及机制进行了初步研究。1.Oct4表达促进剂的筛选及鉴定本文首先将Oct4启动子驱动的荧光素酶报告载体及Oct4 m RNA 3’UTR荧光素酶报告载体分别转染入细胞,之后加入各种待筛选的天然小分子化合物进行刺激,通过检测化合物对荧光素酶活性的影响来筛选靶向Oct4启动子或m RNA3’UTR的Oct4表达促进剂。结果显示,化合物T2-78、T2-79、T3-76、T3-77可以增强Oct4启动子的活性,而T3-21、T3-76、T3-77、T5-46则可以提高Oct4 m RNA的稳定性。之后通过实时定量PCR和Western blot实验,证明这6种小分子化合物均可在m RNA和蛋白水平促进Oct4的表达。2.Oct4表达促进剂在维持干细胞多潜能性中的作用研究为了检测这6种小分子化合物对干细胞特性的影响,我们检测了这些小分子化合物在P19细胞多潜能性的维持和自我更新中的作用。Western blot实验结果显示,只有T2-78、T2-79、T3-77在促进Oct4表达的同时,也促进了干性因子Sox2和Nanog的表达。软琼脂克隆形成实验结果显示,T2-78、T2-79、T3-77能促进P19细胞的克隆形成,并且形成的克隆均能高表达碱性磷酸酶。上述实验结果表明,T2-78、T2-79、T3-77具有维持干细胞特性的潜在能力。由于干细胞可以形成畸胎瘤,并且细胞的多潜能性越高,其形成畸胎瘤时向内、中、外三个胚层分化的程度越高,所以我们将用T2-78、T2-79、T3-77诱导7d的P19细胞分别经皮下注射到裸鼠背部。结果显示,与对照组比较,T2-78、T2-79、T3-77诱导的细胞所形成的畸胎瘤较大,而且瘤组织中内胚层（AFP）、中胚层（c Tn T）及外胚层（β3-tublin）标志物的表达更为明显。这些结果提示,T2-78、T2-79、T3-77可以维持P19细胞的多潜能性。3.Oct4表达促进剂的作用机制研究为了阐明这3种小分子化合物维持干细胞多潜能性的机制,我们通过Western blot方法检测了3种小分子化合物对三条常见的与小鼠干细胞自我更新及多潜能性维持相关的信号通路的影响。结果显示,T2-78可以促进JAK1和STAT3的磷酸化,进而激活JAK/STAT3信号通路,而加入信号通路抑制剂Ruxolitinib则抑制了多潜能因子Oct4的表达,提示化合物T2-78可通过激活JAK/STAT3信号通路来调节Oct4的表达,进而维持干细胞的自我更新和多潜能性;T2-79和T3-77则可以提高胞浆中磷酸化GSK3β的水平,促进β-catenin的核转位,而用Wnt信号通路抑制剂Salinomycin阻断该信号通路时Oct4的表达下降,提示这两个化合物通过激活经典的Wnt信号通路来维持干细胞的自我更新及多潜能性;同时T2-79和T3-77也能够促进PI3K和Akt的磷酸化,当用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002来抑制该信号时,细胞内Oct4的表达下降,提示T2-79和T3-77也可通过激活PI3K/Akt信号通路促进Oct4的表达,进而维持细胞的多潜能性。综上所述,本文以Oct4为靶点筛选出3种可以促进Oct4表达,并可维持干细胞自我更新能力和多潜能性的天然小分子化合物,并对其作用机制进行了初步探讨。本研究为在体外大量扩增干细胞提供了可维持其多潜能性的小分子添加剂,同时也为诱导性多能干细胞的制备提供了候选诱导剂。