猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起猪的一类具有高度危害性的传染病,具有高度接触性、传播快速的临床特点。在当前的养殖过程中,由于疫苗的不恰当使用和病毒自身变异等因素,猪瘟的流行发生了改变,在猪群中该病从大规模的流行转变为地方性散发,在个体猪只中该病多以非典型性、慢性及隐性形式出现,这种非典型性、慢性及隐性带毒常常会出现在母猪群中,造成妊娠母猪流产,产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,同时也会造成母猪的垂直传播及猪群中水平传播,从而给养猪业带来极大的危害。本研究通过制备抗猪瘟病毒单克隆荧光抗体,旨在为猪瘟病毒的检测提供一种快速而又敏感的检测试剂。具体研究内容如下：1.猪瘟病毒单克隆荧光抗体的制备复苏和扩大培养由本实验室研制的猪瘟主要保护性抗原E2囊膜蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞AH9株,通过Babl/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,大量制备了猪瘟单克隆抗体,运用辛酸-硫酸铵法与Sephadex G-25快速蛋白纯化系统进行纯化,得到浓度较高的猪瘟单克隆抗体(蛋白浓度为11.491mg/mL)。经SDS-PAGE电泳检测,在25kDa和50kDa处可以看到两条清晰的条带,证明纯化后的猪瘟单克隆抗体纯度高。运用ELISA法对该单克隆抗体的效价进行测定,效价为1：51200。以异硫氰酸荧光素(FITC)为标记物,采用透析法进行标记,成功制备了免疫荧光猪瘟病毒单克隆抗体检测试剂。2.猪瘟病毒单克隆荧光抗体最佳试验条件的摸索通过对固定剂及固定时间的确定、抗体工作浓度的确定、抗体孵育时间的确定、特异性实验、敏感性实验、符合对比性实验、重复性实验、保存期实验等试验条件摸索。最终我们确定最佳实验条件为：固定条件为60%丙酮+40%乙醇在-20℃下固定30min;抗体最佳工作浓度为1：300；最佳抗体孵育时间为60min;与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪乙脑病毒等其它常见病原无交叉反应,特异性好；该方法与Real-time PCR样品检出率敏感性相差2个数量级,与RT-Nested PCR样品检出敏感性相差1个数量级,表明用此荧光抗体作为检测试剂具有较高的敏感性；对已知背景的95份样品分别采用直接免疫荧光和RT-Nested试验进行检测,以评定其符合率,结果显示两种检测方法的总符合率达到88.42%,方法间符合率较高；重复性实验结果显示该方法的重复性较好；保存期实验显示,将该荧光抗体于-20℃保存6个月后体依然具有很高的特异性和敏感性。3.猪瘟荧光抗体的临床应用运用冰冻切片技术对2012年9月至11月猪场送检的463份组织病料(肾脏、淋巴结、扁桃体)进行处理,按照已摸索的最佳猪瘟病毒荧光抗体工作条件进行检测,检测结果显示猪瘟病毒抗原呈阳性的病料共62份,送检样品阳性率为13.39%。