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[目的]臭蛙的皮肤承担着许多重要的生物学功能,包括防御、呼吸、排泄、体色调节等,其皮肤分泌物中含有许多重要多肽,这些多肽具有特定的生物学活性,如:促创伤修复、抗菌、抗氧化、免疫调节等。因此研究臭蛙皮肤分泌物中的这些多肽有助于新型药物的研发以及为我们理解两栖动物适应环境的分子基础提供依据。[方法]用Sephadex G-75层析柱和RP-HPLC对皮肤分泌物进行分离纯化,收集具有ABTS自由基清除活性的峰,然后进行一级结构测定;提取臭蛙皮肤RNA,合成cDNA,构建cDNA文库;合成多肽;检测样品的抗氧化活性、抗菌活性、促创伤修复活性、免疫调节活性(TNF-α和TGF-β1)、溶血活性及急性毒性作用;应用HE染色及免疫组化染色观察创伤组织变化情况。[结果](1)从云南臭蛙皮肤分泌物中分离纯化出的cathelicidin-OA1从N端到C端的成熟肽序列为’IGRDPTWSHLAASCLKCIFDDLPKTHN’,它的前体肽是由198个氨基酸组成,通过质谱检测其相对分子质量为3035.5 Da,而其理论分子量为3037.5 Da,相差2 Da,提示在第14位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之间形成了一对二硫键。Cathelicidin-OA1的功能和其它已报道的cathelicidin不一样,它没有表现出抗菌性、溶血性及急性毒性作用,但表现出抗氧化活性,它具有清除ABTS和DPPH自由基的活性。更重要的是cathelicidin-OA1表现出促创伤修复活性:在细胞水平上,cathelicidin-OA1通过促进HaCaT细胞的增殖及HSF细胞的迁移从而达到促创伤修复作用;在小鼠动物模型上,cathelicidin-OA1与阴性对照组相比较同样表现出促创伤修复作用。我们通过HE染色,观察组织学变化,发现经cathelicidin-OA1处理的创伤处皮肤与阴性对照组相比,其上皮和肉芽组织增生活跃,从而达到快速愈合的效果。我们还进一步经过免疫组化分析得出cathelicidin-OA1通过促进炎症因子TNF-α的释放从而招募更多的巨噬细胞迁移到创伤处,进而引起炎症因子TGF-β1的释放,达到促进皮肤创伤修复的效果。(2)从云南臭蛙皮肤分泌物中分离纯化出的另一条抗氧化肽是OA-VI12。OA-VI12的前体肽由59个氨基酸组成,从N端到C端的成熟肽序列为’VIPFLACRPLGL’,经质谱检测它的相对分子质量为1298.65 Da,理论分子量为1297.76 Da,不存在翻译后修饰作用。经功能检测分析,同样具有清除ABTS、DPPH、Fe3+和NO自由基的活性,并且C7在ABTS+和Fe3+清除活性中起重要作用,F4,C7和P9在DPPH自由基清除活性中起重要作用,P9在NO自由基清除活性中起重要作用。(3)从绿臭蛙皮肤分泌物中分离纯化出的一条抗氧化肽OM-GF17。OM-GF17的前体肽由61个氨基酸组成,从N端到C端的成熟肽序列为’GFFKWHPRCGEEHSMWT’,相对分子质量为2135.7 Da,理论分子量为2135.40 Da,不存在翻译后修饰作用。功能分析得出OM-GF17具有清除ABTS、DPPH、Fe3+和NO自由基的活性,并且根据实验结果分析得出在多肽OM-GF17中F2/3,W5/16,P7,C9和M15在ABTS自由基清除活性中起协同作用;F2/3,M15和W16对DPPH清除活性起重要作用;C9在Fe3+清除活性中起重要作用;F2/3和M15对NO清除活性起重要作用。[结论](1)从云南臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到一个新型抗氧化肽cathelicidin-OA1,成熟肽氨基酸序列’IGRDPTWSHLAASCLKCIFDDLPKTHN’,在两个半胱氨酸之间有一对二硫键的形成。经过功能分析,cathelicidin-OA1不像其它cathelicidin,它没有表现出直接的抗菌活性、溶血性和急性毒性作用,但是具有抗氧化活性。更重要的是,cathelicidin-OA1在细胞水平和动物模型上都表现出促创伤修复活性。(2)从云南臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到的另外一个抗氧化肽OA-VI12(VIPFLACRPLGL),也表现出ABTS+、DPPH、NO、Fe3+清除活性,同样检测OA-VI12 结构突变后的抗氧化活性,结果显示C7在ABTS+和Fe3+清除活性中起重要作用,F4,C7和P9在DPPH自由基清除活性中起重要作用,P9在NO自由基清除活性中起重要作用。(3)从绿臭蛙皮肤分泌物中分离纯化出的抗氧化肽OM-GF17(GFFKWHPRCGEEHSMWT),表现出 ABTS+、DPPH、NO、Fe3+清除活性,同时检测OM-GF17结构突变后的抗氧化活性,结果显示F2/3,W5/16,P7,C9和M15在ABTS自由基清除活性中起协同作用;F2/3,M15和W16对DPPH清除活性起重要作用;C9在Fe3+清除活性中起重要作用;F2/3和M15对NO清除活性起重要作用。