论文部分内容阅读
第一部分 高脂血症大鼠急性胰腺炎模型的建立及评价目的:探索建立高脂血症大鼠急性胰腺炎模型的方法,并进行评价。方法:72只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组（N组）与P-407 0.12g/kg（H1组）、P-407 0.25g/kg（H2组）和P-407 0.50g/kg（H3组）,每组再分为1周（W1组）、2周（W2组）和4周（W4组）三个亚组,每组6只。H组大鼠通过腹腔注射相应剂量和时间的P-407建立高脂血症模型,尾静脉采血后,采用20%L-精氨酸腹腔注射的方法建立急性胰腺炎模型。各组大鼠均于造模完成后24小时剖杀取材。全自动生化分析仪检测大鼠尾静脉血中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的水平以及大鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LIP）的水平,光学显微镜下观察胰腺的组织病理学改变并评分。结果:与N组大鼠相比,H组大鼠血清TG、TC的水平均明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;且H组大鼠血脂水平随着腹腔注射P-407剂量的增加和时间的延长而逐渐升高;0.25g/kg P-407连续腹腔注射2周后,TG>1000mg/dl;H组大鼠血清ALT、AST、Cr、BUN的水平与N组相比,差异无统计学意义（P>0.05）;大鼠急性胰腺炎造模后,血清AMY、LIP均明显升高,光镜下可见胰腺病理损伤程度随着腹腔注射P-407剂量的增加和时间的延长而逐渐加重。结论:1、以0.25g/kg P-407每日腹腔注射一次,连续2周后,给予2.5g/kg L-精氨酸（p H7.0）腹腔注射2次,间隔一小时,即可成功构建高脂血症大鼠急性胰腺炎模型;2、大鼠血脂水平随着腹腔注射P-407剂量的增加和时间的延长而逐渐升高;3、高脂血症大鼠急性胰腺炎的严重程度随着血脂的升高而逐渐加重。第二部分 高脂血症大鼠急性胰腺炎胰腺损伤情况及RIP3在胰腺中的表达目的:通过建立高脂血症大鼠急性胰腺炎模型,比较高脂血症大鼠急性胰腺炎与非高脂血症大鼠急性胰腺炎胰腺损伤情况并初步探索其可能机制。方法:48只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为正常组（N组）与高脂血症组（H组）,每组再分为对照组（Control组）和急性胰腺炎12h组（AP12h组）、24h组（AP24h组）和48h组（AP48h组）四个亚组,每组6只。根据第一部分的结果,高脂血症组给予0.25g/kg P-407每日腹腔注射,连续注射2周。采用20%L-精氨酸腹腔注射的方法建立急性胰腺炎模型。各组大鼠造模完成后均于相应时间点剖杀取材。全自动生化分析仪检测大鼠血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LIP）及肝功能（ALT、AST水平）和肾功能（Cr、BUN）的变化情况;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清炎症介质TNF-α、IL-6水平;光学显微镜下观察胰腺的组织病理学改变并评分;透射电子显微镜下观察胰腺腺泡细胞的超微结构改变;免疫荧光法检测胰腺组织中MPO的表达水平;免疫组织化学法检测胰腺组织中RIP3的表达水平。结果:与Control组相比,除了NAP12h组外,AP组各时间点大鼠血清AMY、LIP的活性水平、肝功能及肾功能、血清炎症介质水平及胰腺病理评分均有所升高,且均随着时间延长而逐渐升高;与NAP组同一时间点相比,HAP组大鼠血清中AMY、LIP稍有降低,但ALT、AST、Cr、BUN及TNF-α、IL-6、胰腺病理评分及MPO阳性细胞数量均显著升高（P<0.05）,且HAP12h组胰腺既已出现明显的病理损伤,而NAP12h组尚未见明显病理损伤。电镜结果显示NAP组胰腺腺泡细胞以凋亡为主,HAP组以坏死为主;免疫组织化学结果显示HAP组大鼠胰腺组织中RIP3的水平随着时间延长而逐渐升高,且均较相应时间点NAP组高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1、高脂血症大鼠急性胰腺炎较非高脂血症大鼠急性胰腺炎时胰腺损伤出现时间更早,损伤更重;2、高脂血症大鼠急性胰腺炎时胰腺损伤的重症化可能与程序性坏死有关。第三部分程序性坏死在高脂血症大鼠急性胰腺炎胰腺损伤中的作用目的:明确程序性坏死在高脂血症大鼠急性胰腺炎胰腺损伤中的作用。方法:24只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为高脂对照组（H组）、高脂血症大鼠急性胰腺炎组（HAP组）、溶剂对照组（Vehicle组）和Nec-1干预组（Nec-1组）（N=6）。所有大鼠均以0.25g/kg P-407每日腹腔注射,连续注射2周。采用20%L-精氨酸腹腔注射的方法建立急性胰腺炎模型。Nec-1组大鼠在急性胰腺炎造模前1h予以1.65mg/kg Nec-1腹腔注射,Vehicle组予以相同剂量的溶剂,随后建立急性胰腺炎模型。各组大鼠均于造模完成后24h剖杀取材。全自动生化分析检测大鼠血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LIP）的变化情况;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清炎症介质TNF-α、IL-6水平;试剂盒检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）水平;光学显微镜下观察胰腺的组织病理学改变并评分;透射电子显微镜下观察胰腺腺泡细胞的超微结构改变;免疫荧光法检测胰腺组织中MPO和IL-6的表达;免疫组织化学和Western Blot法检测胰腺组织中RIP1、RIP3及MLKL的表达水平。结果:与H组大鼠相比,HAP组大鼠血清中AMY、LIP活性明显升高,胰腺出现明显病理损伤,病理评分显著增高,且胰腺组织中MPO阳性细胞数目增多,胰腺组织和血清中炎症因子TNF-α、IL-6的含量也显著升高。而给予Nec-1处理后,大鼠血清中AMY、LIP活性水平显著降低,胰腺组织病理损伤明显改善,且病理评分也随之下降,胰腺组织中MPO阳性细胞数量也大幅降低,同时,也明显抑制了胰腺组织和血清中TNF-α、IL-6的表达（P<0.05）。进一步地,给予Nec-1预处理后能够显著改善腺泡细胞的坏死情况,降低大鼠血清中LDH水平,同时抑制了胰腺组织中程序性坏死关键分子RIP1、RIP3和MLKL的表达。结论:1、程序性坏死参与了高脂血症大鼠急性胰腺炎时的胰腺损伤过程;2、Nec-1通过抑制程序性坏死,减轻高脂血症大鼠急性胰腺炎时胰腺损伤和炎症反应,发挥对胰腺的保护作用。